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.2016年7月;30(7):763-82.
doi:10.1210/me.2016-1008。 Epub 2016年5月11日。

间质细胞类固醇生物合成中ACBD2/ECI2介导的过氧化物酶体-线粒体相互作用

附属公司

ACBD2/ECI2-介导过氧化物酶体-线粒体在Leydig细胞类固醇生物合成中的相互作用

锦江扇等。 分子内分泌学. 2016年7月.

摘要

脂肪酸代谢和类固醇生物合成是过氧化物酶体和线粒体共有的两条主要途径。这两个细胞器都与内质网紧密并列,它们通过细胞器间膜接触点与内质网上进行沟通,以促进细胞信号传递和离子和脂质的交换。迄今为止,没有令人信服的证据表明哺乳动物细胞中过氧化物酶体和线粒体之间存在直接接触。激素诱导的、严格控制的类固醇激素生物合成需要细胞间的相互作用。利用免疫荧光染色和活细胞成像,我们发现MA-10小鼠肿瘤Leydig细胞的二丁基环腺苷酸处理可快速诱导过氧化物酶体接近线粒体并形成过氧化物酶体线粒体接触位点/融合,内源性酰基辅酶A结合域(ACBD)的亚细胞分布揭示了这一点通过选择性剪接产生的2/ECI2亚型A,并使用邻近连接分析进一步验证。这一事件可能通过过氧化物酶体样结构发生,该结构由过氧化物酶和线粒体基质蛋白输入复合物介导:过氧化物体输入受体过氧化物质体生物发生因子5(PEX5)和线粒体外膜20同源(酵母)蛋白的线粒体输入受体亚单位转定位酶。使用mLTC-1小鼠肿瘤Leydig细胞也获得了类似的结果。ACBD2/ECI2亚型A在MA-10细胞中的异位表达导致基础类固醇和激素刺激类固醇的形成增加,表明ACBD2/ECI2介导的过氧化物酶体-线粒体相互作用有利于这两个细胞器之间的代谢产物和/或大分子的交换,以支持类固醇生物合成。考虑到ACBD2/ECI2蛋白的广泛存在,我们建议该蛋白可以作为一种工具来帮助理解过氧化物酶体和线粒体之间的接触。

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数字

图1。
图1 ACBD2/ECI2蛋白质及其密切相关蛋白质的结构域、亚型和序列比对。
A、 ACBD2/ECI2、ECI3和ECI1/DCI蛋白质结构域的比较。显示了潜在的线粒体靶向序列或前序列(M)和推测的PTS1s(P);P序列表示为−PKL(−Pro-Lys-Leu-COOH)和−AKL(−Ala-Lys-Leu-COOH)。ECH催化2-酯酰基-CoA水合为3-羟酰基-Co A。DCI,十二烯酰基CoA异构酶,作为ECI1的别名。B、 小鼠(m)和人类(h)ACBD2/ECI2亚型和ECI3蛋白N末端的序列比对。人类和小鼠ACBD2/ECI2亚型A(mACBD2/ECI2-IsoA和hACBD2/EC I2-Iso 1)的假定线粒体前序列(M)均已显示。C、 如B所示,ACBD2/ECI2亚型和ECI3蛋白C末端的序列比对。PTS1(P)用红色方框表示。
图2。
图2.新品种的鉴定Acbd2/Eci2公司基因特异性PCR、Sanger测序和基因组定位的mRNA序列。
A、 从外显子1到外显子2的基因组区域的重点Acbd2/Eci2公司基因,具有6个序列变种Acbd2/Eci2公司来自该基因组位点的转录物。异构体A、B和C与GenBank中报道的序列变体相同(分别为NM_001110331、NM_011868和NR_073427),在MA-10细胞中发现的另外3个新序列变体分别为D、E和F。第一个ATG和替代的第二个ATG(红条),以及外显子1的替代3′端(E1–3′)和外显子2(E2–5′)拼接的5′端用虚线表示。琼脂糖凝胶摄影术(indel)显示了用于扩增外显子1和外显子2之间部分的基因特异性PCR(R/F或R'/F)。M、 1 Kb加DNA梯形图(Invitrogen)。箭头表示PCR扩增物。B、 序列色谱图Acbd2/Eci2公司mRNA变种显示为VA、VB和VC,这三种变种之前已确定Acbd2/Eci2公司转录物,通过序列多样性特异性PCR进一步证实;VD、VE和VF代表新增的3种mRNA变体。红色虚线矩形方框表示其他序列变种中缺失的特定序列TGTCCTGCAG。红色箭头表示缺少VA、VB、VD和VE中存在的10个基本序列的站点。
图3。
图3.出现Acbd2公司/Eci2公司通过熔解曲线分析检测dbcAMP处理后的变异体A,并通过内源性ACBD2/ECI2蛋白的免疫荧光分析进行确认。
A、 每个熔炼曲线轮廓Acbd2/Eci2公司MA-10 Leydig肿瘤细胞中不同mRNA库的mRNA亚型。用1mM dbcAMP治疗后2、6或10小时收集mRNA。根据x轴上的温度(°C)绘制y轴上的荧光(导数报告器,−Rn)。熔融温度越高,PCR产物的尺寸越大,GC%越高,从而决定了亚型。VA、VB和VC对应于Acbd2/Eci2公司mRNA种类:分别为A、B和C。B和C,dbcAMP治疗前MA-10细胞中ACBD2/ECI2蛋白的免疫细胞荧光分析。用山羊抗PECI抗体在MA-10细胞中检测到ACBD2/ECI2蛋白(绿色,大体上是B亚型),并用Alexa Fluor 488驴源次级抗原IgG(H+L)抗体成像。DAPI(蓝色)和MitoTracker CMXRos(红色)分别用作细胞核和线粒体的反染色。分析中高亮显示的区域显示在C中,其中2个分离的通道(绿色和红色)显示在右侧。D和E,dbcAMP处理后MA-10细胞中ACBD2/ECI2蛋白的免疫细胞荧光分析。山羊抗PECI抗体在MA-10细胞中检测到ACBD2/ECI2蛋白(绿色,大体上是同种型B;黄色,同种型A,唯一可以与线粒体染色重叠的形式),该抗体用二级Alexa Fluor 488驴抗山羊IgG(H+L)抗体成像。DAPI(蓝色)和MitoTracker CMXRos(红色)分别用作细胞核和线粒体的反染色。分析中高亮显示的区域显示在E中,其中2个分离的通道(绿色和红色)显示在右侧。使用FV10-ASW 3.1查看器记录图像。P、 过氧化物酶体;M、 线粒体。比例尺,5μM。F和G,内源性基因敲除Acbd2/Eci2公司mRNA使用对照siRNA(F)或Acbd2/Eci2型-dbcAMP治疗后的特异性siRNAs(G)。插图,细胞内显示抗ACBD2/ECI2蛋白(绿色)和MitoTracker CMXRos染色(红色)共定位的放大区域。染色条件如B-E所示。H、 绿色ACBD2/ECI2蛋白免疫荧光染色与红色线粒体的相关性。dbcAMP处理后,Rr值接近0.4,显著高于对照组。使用Student’st吨测试;*,P(P)≤ .05; n=6。一、 图表显示了dbcAMP刺激前后,过氧化物酶体ACBD2/ECI2-亚型B或B/A通过过氧化物酶体(P)或P*与线粒体的关联。TOMM20,OMM受体亚单位的前序列识别。
图4。
图4共焦激光显微镜荧光活细胞成像显示ACBD2/ECI2的亚细胞靶向性。
A、 用于活细胞成像的代表性质粒结构DsRed-ACBD2/ECI2和ACBD2/ECI2-DsRed的示意图。将ACBD2/ECI2的开放阅读框融合到DsRed单体荧光蛋白的N端或C端。M、 线粒体前序列;−PKL、PTS1信号序列。B、 DsRed-ACBD2/ECI2融合蛋白(红色)的过氧化物酶体定位。AmCyan-PEX11β,过氧化物酶体膜标记(绿色)。PEX11β,一种过氧化物酶体完整膜蛋白11β。Hoechst 33342,细胞核(蓝色)。比例尺,2μm。右侧面板突出显示放大区域,其中DsRed-ACBD2/ECI2的过氧化物酶体定位显示为黄色/红色;下图显示了ACBD2/ECI2的过氧化物酶体位置。P、 过氧化物酶体。M、 线粒体C,过氧化物酶体DsRed-ACBD2/ECI2的线粒体附着(红色)。Mito-roGFP被用作Mito-H细胞(绿色)的线粒体基质标记物。Hoechst 33342,细胞核(蓝色)。比例尺,2μm。放大区域显示在右侧面板中,图表显示DsRed-ACBD2/ECI2的线粒体附着。红色和绿色、黄色之间的颜色化。D、 ACBD2/ECI2-DsRed融合蛋白(Red)的线粒体定位。线粒体roGFP,线粒体基质标记物(绿色)。Hoechst 33342,细胞核(蓝色)。比例尺,2μm。红/绿通道之间重叠的放大图如右图所示,图中显示了ACBD2/ECI2-DsRed的线粒体定位。
图5。
图5:DsRed-ACBD2/ECI2揭示的接触位点或过氧化物酶体和线粒体之间对dbcAMP反应的“融合”的定量共定位分析。
A、 细胞的代表性图像,显示过氧化物酶体DsRed-ACBD2/ECI2(红色)和丝裂原GFP(绿色)的共定位(白色),如插页所示。箭头表示过氧化物酶体和线粒体之间的接触部位或融合。比例尺,10μm。B、 dbcAMP治疗前后过氧化物酶体和线粒体之间ACBD2/ECI2介导的接触位点数量的盒须图。图下方的高倍图像突出显示了量化接触部位的示例。使用Mann-Whitney检验进行统计分析(*,P(P)< .05; n=单个光学部分上的15个单元)。C和D,图像的红色和绿色像素强度的散点图,如A所示。散点图分为4个区域,象限(C)。右上方象限代表绿色和红色的高强度像素,可用于计算两个通道的共定位像素:DsRed-ACBD2/ECI2和Mito-roGFP,如D和A.E和F所示,内源性ACBD2/ECI2(过氧化物酶体)和TOMM20(线粒体)之间的共定位PLA Duolink-In-cell co-IP(红色)在无(E)培养物和目前1mM dbcAMP培养物中观察2小时(F)。插图,放大区域,显示红色斑点作为PLA信号。G、 1mM dbcAMP治疗前后共定位ACBD2/ECI2和TOMM20点状或接触部位的量化条形图。平均值±SD;***,学生的t吨测试,P(P)< .001; n=291(控制)和n=220(1mM dbcAMP)。H、 ACBD2/ECI2和TOMM20之间的PLA图。ACBD2/ECI2-A作为与OMM受体TOMM20结合的N末端前序列,对dbcAMP治疗产生反应。显示了抗-ACBD2和抗TOMM20抗体。PLA,红点;P、 过氧化物酶体;M、 线粒体。
图6。
图6天然ACBD2/ECI2蛋白亚型A的重建。
A、 丝裂原-DsRed-ACBD2/ECI2质粒结构图,模拟天然ACBD2/ECI2蛋白结构,其中N端和C端都是自由的。克隆中使用的两种限制性内切酶如下所示Nco公司我和巴姆你好。M、 预序列;DsRed、DsRed单体荧光蛋白。B、 mito-H细胞中mito-DsRed-ACBD2/ECI2蛋白的共焦激光显微镜活细胞成像。Mito-DsRed-ACBD2/ECI2,红色;线粒体roGFP,绿色指示线粒体;赫斯特(蓝色),细胞核。右侧面板显示局部图像的更高放大率。P、 过氧化物酶体;M、 线粒体。比例尺,2μM。C、 线粒体-H细胞中线粒体-DsRed-ACBD2/ECI2蛋白(红色)和过氧化物酶体膜标记物:AmCyan-mPMP70(绿色)的共焦激光显微镜活细胞图像。赫斯特(蓝色),细胞核。比例尺,5μm。D、 描述细胞中有丝分裂-DsRed-ACBD2/ECI2蛋白亚细胞定位的代表性定量分析的饼图。线粒体(M)中蛋白质的荧光强度根据丝裂原GFP标记测定为48%,过氧化物酶体(P)中蛋白质荧光强度根据mPMP70标记测定为23%,这两个细胞器之间的蛋白质荧光强度(P*)为29%,与每个细胞的总荧光强度之比。左面板,从B中提取的图像,显示线粒体有丝分裂-DsRed-ACBD2/ECI2。右面板,从C中提取的图像,显示过氧化物酶体Mito-DsRed-ACBD2/ECI2。E、 MA-10细胞裂解物亚细胞组分中内源性ACBD2/ECI2的免疫印迹分析。COX IV被用作线粒体内膜标记蛋白(Mito);SCPX用作过氧化物酶体标记物(Pero);和GAPDH作为全细胞溶菌酶负荷控制。M、 以kDa表示的蛋白质标记;全细胞裂解物总量;细胞、胞浆组分;线粒体富集组分。F、 MA-10细胞(红色)和VDAC1(OMM标记;绿色)内源性ACBD2/ECI2的双重免疫荧光染色。细胞核也用DAPI(涂成绿色)进行复染。放大的局部染色显示在右侧面板上。比例尺,5μm。
图7。
图7.Mito-DsRed-ACBD2/ECI2介导的过氧化物酶体样结构,P*。
A、 用过氧化物酶体整体膜蛋白AmCyan-mPEX11β(绿色)对丝裂原-DsRed-ACBD2/ECI2(红色)进行定殖分析。赫斯特(蓝色),细胞核。中间面板显示放大的染色。P、 过氧化物酶体;P*,白色箭头;M、 线粒体(虚线)。比例尺,2μm。右图显示了ACBD2/ECI2揭示的过氧化物酶体和线粒体之间的关系。分离的过氧化物酶体(绿色)表明ACBD2/ECI2(红色)位于PEX11β内或一侧;与线粒体相关的过氧化物酶体(红色)通过TOMM20连接为P*。B、 用过氧化物酶体基质蛋白AmCyan-pero(绿色)对丝裂原-DsRed-ACBD2/ECI2(红色)进行染色分析。赫斯特(蓝色),细胞核。放大染色显示在中间面板中。P*,连接线粒体;M、 虚线,由ACBD/ECI2表示。比例尺,2μm。右图显示了ACBD2/ECI2揭示的过氧化物酶体和线粒体之间的关系。分离的过氧化物酶体(绿色)表明ACBD2/ECI2(红色)位于细胞器的一侧;与线粒体相关的过氧化物酶体(绿色)通过TOMM20连接为P*。C、 双靶向控制蛋白mito-DsRed-pero(红色)与AmCyan-mPEX11β(绿色)的定殖分析。赫斯特(蓝色),细胞核。中间面板显示放大的染色。P、 绿色/黄色;M、 红色。比例尺,2μM。右图显示过氧化物酶体包含过氧化物酶膜蛋白PEX11β(绿色)和位于细胞器一侧的基质mito-DsRed-pero(红色),而线粒体仅包含基质mito-DsRed-pera(红色)。D、 用线粒体基质蛋白mito-roGFP(绿色)对线粒体-DsRed-pero(红色)进行染色分析。赫斯特(蓝色),细胞核。中间面板中显示了一个放大的突出显示。比例尺,2μm。右侧面板中的图表表明过氧化物酶体仅包含基质mito-DsRed-pero(红色),而线粒体同时包含基质mita-DsRed-pero(红)和基质mito-roGFP(绿)。
图8。
图8 P*的形成分别涉及来自2个亚细胞基质蛋白导入受体复合物的PEX5和TOMM20。
A、 假定P*的图解结构。PEX5,PTS受体;PTS1蛋白,含PTS1的蛋白;前序列,线粒体靶向序列;线粒体输入受体亚单位TOMM20;P、 过氧化物酶体;M、 线粒体B–D,TOMM20的异位表达(蓝色)对DsRed-ACBD2/ECI2(红色)(B)的过氧化物酶体定位没有影响,但导致线粒体DsRed-ACBD2/ECI2(红色。比例尺,5μm。来自C的Rr远不为零,并且与B的Rr显著不同,这表明线粒体导入线粒体DsRed-ACBD2/ECI2蛋白(D)。各散点图下方显示了DsRed-ACBD2/ECI2的过氧化物酶体定位图以及线粒体-DsRed-ACB D2/ECI1的过氧化物酶体和线粒体双重定位图。使用Student’st吨测试;***,P(P)≤ .001; n=5。E–G,使用Pex5型-特异性siRNAs导致DsRed-ACBD2/ECI2(过氧化物酶体基质蛋白)积累较少。测量了PEX5敲除前后过氧化物酶体的面积,PEX5击倒细胞的强度和/或数量明显较低。比例尺,2μm。各散点图下方显示了DsRed-ACBD2/ECI2的过氧化物酶体定位图,以及在PEX5缺乏情况下其过氧化物酶体定位减少的图。使用Student’st吨测试**P(P)≤ .01; n=5。H–J,使用E–G验证的特异性siRNA敲除PEX5会导致线粒体中有丝分裂-Dsrd-ACBD2/ECI2的普遍积累。Rr值接近1,与可以形成P*的对照细胞的Rr值显著不同,表明有丝分裂-Dsrd-ACBD2/ECI2蛋白的线粒体定位。比例尺,2μm。各散点图下方显示了线粒体-DsRed-ACBD2/ECI2的过氧化物酶体和线粒体双重定位以及PEX5缺乏情况下过氧化物酶位置的丢失。使用Student’st吨测试;***,P(P)≤ .001; n=5。K–M,使用对照siRNAs不会改变mito-DsRed-ACBD2/ECI2蛋白的亚细胞分布,这与5μM高标杆中对照细胞的模式相似。在每个散点图下方显示了一张图,该图显示了使用对照siRNA的线粒体-DsRed-ACBD2/ECI2的过氧化物酶体和线粒体双重定位没有变化。使用Student’st吨测试;P(P)= .48; n=9。
图9。
图9天然ACBD2/ECI2蛋白亚型A异位表达下类固醇生成增加。
A、 本研究使用了5种质粒结构图。每个质粒名称都在括号内和条形图(B和C)中用缩写表示。DsRed、DsRed-单体荧光蛋白;M、 线粒体前序列;−PKL,PTS1肽序列。B和C,在基础水平(B)和dbcAMP治疗2小时后测量Mito-H细胞的孕酮释放(C)。条形图表示转染不同质粒的Mito-H细胞的孕酮测量值(ng/mL蛋白质):mitoHc,对照;DsRedc、mito-DsRed-pero质粒作为载体控制;Mito-DsRed-Acbd2、Mito-DsRed-Acbd2/ECI2质粒;无Acbp结构域的No-Acbp、mito-DsRed-ACBD2/ECI2;具有C末端过氧化物酶体靶向的Pero,DsRed;Mito,DsRed,具有N末端线粒体靶向序列。数据显示为一式三份的4个独立实验的平均值±SD。使用Student’st吨测试;*,P(P)< .05; **,P(P)< .01; n=4。
图10。
图10通过选择性剪接受体位点选择确定ACBD2/ECI2的亚细胞靶向性。
A、 通过选择性自剪接位点选择的蛋白质亚细胞靶向性总图,以及通过荧光ACBD2/ECI融合蛋白(红色)显示P*、过氧化物酶体(接触位点)和线粒体的代表性图像。三种不同的成熟mRNA导致不同的蛋白质转运途径:通过PEX5和TMM20/HSP70之间的竞争性结合机制,ACBD2/ECI2介导的同时指向线粒体和过氧化物酶体的双靶向途径,导致两个细胞器之间的密切接触(左面板);通过PTS1受体PEX5靶向过氧化物酶体的折叠过氧化物酶体基质蛋白(中间面板);并通过线粒体导入受体复合物TOMM20/HSP70(右图)以线粒体为靶点展开线粒体基质蛋白。图中的虚线表示在−PKL的3′末端融合了荧光标记(粉红色椭圆形)的人工转录物。每个面板下方显示了支持每个提议模型的相应的代表性高放大共焦图像。双靶蛋白在过氧化物酶体样结构和线粒体之间的详细分布突出显示在单个红色通道中。比例尺,1μm。M、 线粒体;P、 过氧化物酶体;MTS,线粒体靶向信号PKL,ACBD2/ECI2蛋白中潜在的PTS1序列;HSP70、70-kDa伴侣热休克蛋白;PEX5、PTS1受体。B、 ACBD2/ECI2通过PEX5(灰点)和TOMM20(蓝色)介导P*接近线粒体的示意图。过氧化物酶体、P*或线粒体内的红色斑点代表线粒体和过氧化物酶双重靶蛋白ACBD2/ECI2。MTS,含正电荷氨基酸的MTS(+++);−PKL,ACBD2/ECI2的潜在PTS1序列。

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引用人

工具书类

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赠款和资金

这项工作得到了加拿大卫生研究院MOP-102647拨款和加拿大生物化学药理学研究主席(V.P.)的支持。麦吉尔大学健康中心研究所得到了来自Quebec-SantéLe Fonds de Recherche du Quebecé的中心资助。