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.2016年7月2日；12(7):1129-52.
doi:10.1080/15548627.2016.1178446。 Epub 2016年5月10日。

IL6的一种新的促肿瘤机制和tocilizumab的疗效：低氧诱导的IL6通过p-STAT3-MIR155-3p-CREBRF途径在胶质母细胞瘤中是一种有效的自噬引发剂

郝雪 1 2, 广元 三, 兴国 1 2, 刘清林 1, 张进森（Jinsen Zhang） 1 2, 小高 1, 郭晓凡 1, 徐淑刚 1 4, 童丽 1, 邵向前 5, 严少峰 2, 李刚（音译） 1 2
附属公司

IL6的一种新的促肿瘤机制和tocilizumab的治疗效果：低氧诱导的IL6通过p-STAT3-MIR155-3p-CREBRF途径在胶质母细胞瘤中是一种有效的自噬引发剂

郝雪等。 自噬. .

摘要

缺氧诱导胶质母细胞瘤细胞的保护性自噬，针对这一过程的新治疗途径可能改善胶质母细胞癌患者的预后。最近的研究表明，胶质母细胞瘤的自噬过程在广泛缺氧的反应中上调。缺氧还诱导多种细胞类型中一组特定蛋白质和微RNA（miRNAs）的上调。IL6（白细胞介素6）是一种炎症性自分泌和旁分泌细胞因子，在胶质母细胞瘤中过度表达，由于其促肿瘤作用，已被报道为预后不良的生物标志物。在这里，我们描述了IL6的一种新的促肿瘤机制，即低氧诱导的IL6通过磷酸化（p）-STAT3-MIR155-3p途径在胶质母细胞瘤中充当自噬的有效启动子。IL6和p-STAT3水平与人脑胶质瘤组织中自噬细胞的丰度和HIF1A水平以及人脑胶质胶质瘤的分级相关，而外源性或内源性IL6的抑制抑制了体外胶质母细胞瘤细胞的自噬。内源性MIR155-3p的敲除抑制了IL6诱导的自噬，而MIR155-3的强制表达恢复了IL6抑制剂的抗自噬活性。我们表明，低氧-IL6-p-STAT3-MIR155-3p-CREBRF-CREB3-ATG5通路在恶性胶质瘤进展中起着中心作用，通过tocilizumab阻断IL6受体，在体内异种移植模型中显示出一定程度的治疗效果，尤其是与替莫唑胺联合使用。此外，tocilizumab通过促进肿瘤凋亡抑制自噬。总之，我们的发现为缺氧诱导的神经胶质瘤细胞自噬的分子机制提供了新的见解，并为胶质母细胞瘤患者提供了可能的有效辅助治疗。

关键词：ATG5；CREB3；CREBRF；IL6；STAT3；自噬；胶质母细胞瘤；缺氧；微RNA；tocilizumab公司。

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数字

图1。
图1。
在人脑胶质瘤组织中，共定位IL6、HIF1A、LC3B和p-STAT3水平与WHO分级呈正相关。（A） IL6、HIF1A、p-STAT3和LC3B的表达与胶质瘤的WHO分级呈正相关。采用免疫组织化学方法对90例人脑胶质瘤和3例不同WHO分级的正常脑组织标本进行处理。STAT3水平基本稳定。（B） 连续石蜡切片的免疫组织化学染色显示，IL6、p-STAT3、HIF1A和LC3B蛋白在高级胶质瘤组织（WHO III）样本肿瘤血管周围的缺氧区域共定位（图S1中右下角绿框的放大图）。（C） 不同WHO分级胶质瘤组织IHC染色定量。IRS，免疫反应评分。（D） IL6、p-STAT3、HIF1A、LC3B和年级的Pearson或Spearman rho秩相关检验。
图2。
图2。
缺氧诱导人脑胶质瘤细胞自噬激活并上调IL6。（A） 缺氧促进GFP-LC3B易位。pSELECT-GFP-LC3B转染显示低氧处理U251细胞中存在LC3B点2，5%一氧化碳2和94%N237°C）持续24小时。细胞固定并用DAPI染色以进行核可视化。显示了具有代表性的图像。比例尺：50μm。GFP-LC3B点的定量分析如右图所示。每个实验组至少检查了100个高功率场。所示数据为4个独立实验的平均值±标准差。*，P<0.0001；双尾t检验。（B） 低氧诱导U251和T98G细胞LC3B转化和SQSTM1降解。通过western blot分析检测低氧处理后GBM细胞中LC3B和SQSTM1的水平（1%O2，5%一氧化碳2和94%N2在37°C下）持续12和24小时。GAPDH充当装载控制。（C） Western blot分析表明，3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制U251细胞的自噬，用巴非霉素（BAF）处理正常和缺氧细胞可阻断自噬通量。（D） ELISA显示，缺氧增加了U251和T98G细胞培养上清中IL6的分泌。所示数据为3个独立实验的平均值±标准差。*和#，P<0.001；双尾t检验。
图3。
图3。
IL6诱导自噬激活，IL6的抑制抑制人脑胶质瘤细胞的自噬。（A） 外源性IL6促进GFP-LC3B易位。pSELECT-GFP-LC3B转染的U251细胞经IL6（20 ng/ml）处理24小时。比例尺：50μm。GFP-LC3B点的定量分析如右图所示。所示数据为4个独立实验的平均值±标准差。*，P<0.0001；双尾t检验。（B） 外源性IL6诱导U251和T98G细胞的LC3B转化和STAT3活化。用IL6（20 ng/ml）处理0、12、24 h后，通过western blot分析检测GBM细胞中LC3B、STAT3和p-STAT3的水平。GAPDH充当装载控制。（C） 透射电镜图像显示用IL6（20 ng/ml）处理24小时后U251细胞中的特征性自噬体（箭头）。N、 核心。每个实验组至少检测50个细胞。所示数据为3个独立实验的平均值±标准差。*，P<0.0001；双尾t检验。（D） 经24小时处理后，外源IL6以剂量依赖性方式诱导GBM细胞中LC3B转化和SQSTM1降解。通过western blot分析测定内源性IL6（E）和外源性IL6的抑制抑制GBM细胞中LC3B转化和SQSTM1降解。（G） 巴非霉素A对IL6处理的U251细胞自噬流的抑制作用1（BAF）。ACTB充当装载控制。
图4。
图4。
IL6-p-STAT3通路的激活与低氧诱导的胶质母细胞瘤细胞自噬有关。（A） 抗外源性IL6抗体抑制GFP-LC3B易位。pSELECT-GFP-LC3B转染的U251细胞经IL6（20 ng/ml）和IL6抗体（1μg/ml）处理24小时。比例尺：50μm。GFP-LC3B点的定量分析如右图所示。所示数据为4个独立实验的平均值±标准差。*和#，P<0.001；单因素方差分析。（B） 抗外源性IL6抗体抑制U251和T98G细胞中LC3B转化和STAT3激活。用IL6（20 ng/ml）和IL6抗体（1μg/ml）处理24 h后，通过western blot分析检测GBM细胞中LC3B、STAT3和p-STAT3的水平。GAPDH充当装载控制。（C） 一种针对外源性IL6的抗体抑制了低氧U251细胞中GFP-LC3B的易位。pSELECT-GFP-LC3B转染的U251细胞在缺氧条件下用IL6抗体（1μg/ml）处理24小时。比例尺：50μm。GFP-LC3B点的定量分析如右图所示。所示数据为4个独立实验的平均值±标准差。*，P<0.0001；双尾t检验。（D） 抗外源性IL6抗体抑制缺氧U251和T98G细胞中LC3B转化和STAT3激活。用IL6抗体（1μg/ml）处理低氧GBM细胞24 h后，通过western blot分析检测LC3B、STAT3和p-STAT3水平。GAPDH充当装载控制。
图5。
图5。
MIR155-3p型缺氧上调IL6，IL6可诱导胶质母细胞瘤细胞自噬。（A） miRCURY™RNA表达阵列显示正常氧和缺氧U251细胞之间有84个显著差异表达的miRNAs（部分数据如图5A所示）。低氧miRNA标记MIR210公司和靶miRNAMIR155-3p型显示。（B） 的表达式级别MIR155-3p型用实时定量PCR检测缺氧U251细胞（缺氧处理0、12和24小时）。所示数据为5个独立实验的平均值±标准差。*，P<0.05；***，P＜0.0001；单向方差分析。（C）MIR155-3p型过表达诱导U251和T98G细胞在48小时后LC3B转化和SQSTM1降解MIR155-3p型westernblot分析显示，模拟转染。GAPDH充当装载控制。（D） 外源性IL6上调，抗外源性IL-6抗体抑制MIR155-3p型，通过定量实时PCR测定。所示数据为5个独立实验的平均值±标准差。*，P<0.01；***，P<0.0001；单向方差分析。（E） 内源性IL6的敲除抑制了MIR155-3p型，由定量实时PCR测定。（F） 特异性p-STAT3抑制剂Stattic抑制STAT3的功能。（G） “5′-TTTTCCCCAAA-3′”p-STAT3结合元件存在于MIR155-3p型发起人。p-STAT3结合元件的突变消除了IL6-p-STAT3途径对MIR155-3p型表达式与野生类型元素进行比较。所示数据为5个独立实验的平均值±标准差。*和#，P<0.01；**和##，P＜0.001；***，###和$$$，P<0.0001；*通过Student对Static组和IL6组的t检验，#由学生提供t吨测试IL6组与DMSO对照组，以及$按学生t吨低氧组与常压组的对比试验。
图6。
图6。
MIR155-3p型敲除可拮抗人脑胶质瘤细胞低氧诱导的自噬。（A） MIR155-3p型抑制剂抑制GFP-LC3B易位。pSELECT-GFP-LC3B和MIR155-3p型用IL6（20 ng/ml）处理转染抑制剂的U251细胞24小时。比例尺：50μm。GFP-LC3B点的定量分析如右图所示。所示数据为4个独立实验的平均值±标准差。*和#，P<0.001；单向方差分析。（B）MIR155-3p型抑制抑制U251和T98G细胞中的LC3B转换和STAT3激活。用IL6（20 ng/ml）处理24 h后，通过western blot分析检测GBM细胞中LC3B、SQSTM1、STAT3和p-STAT3的水平。GAPDH充当装载控制。
图7。
图7。
MIR155-3p型过表达增强低氧诱导的自噬，并抵抗IL6抑制对人脑胶质瘤细胞的影响。（A）MIR155-3p型模拟物促进GFP-LC3B易位。pSELECT-GFP-LC3B和MIR155-3p型用IL6抗体（1μg/ml）和siRNAs（Si IL6 321）处理模拟转染U251细胞24小时。比例尺：50μm。GFP-LC3B点的定量分析如右图所示。所示数据为4个独立实验的平均值±标准差。*，#和$，P<0.01；**，P<0.001；***，P<0.0001；单向方差分析。（B） MIR155-3p型在U251和T98G细胞中模拟诱导LC3B转换和STAT3激活。通过蛋白质印迹分析检测LC3B、SQSTM1、STAT3和p-STAT3水平。GAPDH充当装载控制。
图8。
图8。
MIR155-3p型通过直接靶向人脑胶质瘤细胞中的CREBRF-CREB3-ATG5通路，增强低氧诱导的自噬。（A） 最佳潜力MIR155-3p型miRDB中的目标基因CREBRF和3′-UTR种子突变。（B） U251胶质瘤细胞中3′-UTR种子突变和3′-UCR荧光素酶检测。荧光素酶活性MIR155-3p型-转染细胞的活性降低到使用对照miRNA观察到的活性的一半左右。（C）MIR155-3p型CREBRF和CREB3的蛋白质水平。我们在48小时后进行了western blottingMIR155-3p型将抑制剂和模拟物转染到U251和T98G细胞中，观察到低氧处理的U251细胞和T98G细胞中CREBRF蛋白水平显著降低。由于CREBRF是CREB3的负调节因子，CREB3水平呈现相反的趋势。（D） CREB3级siRNA敲低降低U251和T98G细胞的自噬水平和ATG5蛋白水平。（E） western blotting检测原发性胶质瘤细胞中的关键通路蛋白。（G） 定量实时PCR检测CREB3诱导U251和T98G细胞自噬相关（ATG）基因。（H）CREB3级siRNA抑制GFP-LC3B易位。pSELECT-GFP-LC3B转染的U251细胞经IL6（20 ng/ml）处理24小时。比例尺：50μm。GFP-LC3B点的定量分析如右图所示。所示数据为4个独立实验的平均值±标准差。*和#，P<0.05；**和##P<0.01；双尾t检验。155i，MIR155-3p型抑制剂；1.55亿，MIR155-3p型模仿；NC，阴性对照。
图9。
图9。
抑制IL6可诱导GBM细胞凋亡。（A） 进行CCK-8分析以评估缺氧处理的U251细胞在存在或不存在IL6抗体的情况下48小时的细胞活力。（B） 和（C）ANXA5 FITC-PI和TUNEL染色检测IL6抗体（1μg/ml）处理的低氧GBM细胞的凋亡水平。（D） IL6抗体（1μg/ml）在缺氧的GBM细胞中诱导PARP和CASP3的裂解。western blot分析检测PARP、裂解PARP、CASP3和裂解CASP3水平。GAPDH充当装载控制。数据为平均值±标准差*，与对照组相比P<0.01。
图10。
图10。
IL6单克隆抗体tocilizumab通过抑制IL6诱导的自噬和促进凋亡来抑制体内GBM细胞的生长。（A） 和（B）根据肿瘤体积测量，Tocilizumab显著抑制U251细胞异种移植物中的肿瘤生长。*，与对照组相比，P<0.001。(C类)经ELISA检测，与对照组相比，tocilizumab组外周血血清中的IL6保持在较低水平，与对照组相比，P<0.001。（D） 通过免疫组织化学染色评估，Tocilizumab降低了所有异种移植标本中IL6、p-STAT3和LC3B的表达。（E） Tocilizumab抑制异种移植物的增殖并诱导凋亡。免疫组织化学染色检测所有异种移植物标本中KI67和裂解CASP3的表达。
图11。
图11。
抗ilizumab的IL6单克隆抗体通过抑制IL6诱导的自噬和促进凋亡，提高替莫唑胺在体内治疗GBM的效率。（A） 和（B）根据肿瘤体积测量，Tocilizumab和替莫唑胺联合治疗显著抑制U251细胞异种移植物中的肿瘤生长。*，与对照组相比P<0.05。#与替莫唑胺组相比，P<0.05。（C） 通过免疫组织化学染色检测，Tocilizumab降低了替莫唑胺处理的异种移植物标本中IL6、p-STAT3和LC3B的表达并诱导凋亡。
图12。
图12。
IL6新的促肿瘤机制和tocilizumab治疗效果的模型和假设：低氧诱导的IL6通过p-STAT3在胶质母细胞瘤中是一种有效的自噬引发剂-MIR155-3p型-CREBRF途径。肿瘤血管周围的缺氧区域（图1B）和低氧诱导的IL6通过p-STAT3触发缺氧性胶质瘤细胞自噬-MIR155-3p型-CREBRF途径。由于上调的自噬抑制肿瘤凋亡并促进增殖，我们使用tocilizumab阻断IL6受体，并通过从自噬转变为凋亡来显著抑制肿瘤生长。TAM，肿瘤相关巨噬细胞。
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