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.2016年7月；17(7):953-64.
doi:10.15252/embr.201642077。 Epub 2016年5月6日。

CLPP缺失可缓解线粒体心肌病，但不会影响哺乳动物UPRmt

多米尼克·塞弗林 1, 卡罗琳娜·斯泽帕诺夫斯卡 1, 克里斯蒂娜·贝克尔 1, 凯瑟琳·森夫特 1, 斯特芬·赫尔曼斯 1, 普里扬卡·麦蒂 1, 蒂姆·科尼格 2, 亚历山德拉·库卡特 1, 亚历克桑德拉·特里芬诺维奇 3
附属公司

CLPP缺失可缓解线粒体心肌病，但不会影响哺乳动物UPRmt

多米尼克·塞弗林等。 EMBO代表. 2016年7月.

摘要

线粒体基质蛋白酶CLPP在秀丽隐杆线虫线粒体未折叠蛋白反应（UPR（mt，我们删除了DARS2缺陷动物心脏中的CLPP，这些动物由于线粒体翻译的强烈失调而表现出强烈的UPR（mt）诱导。值得注意的是，我们的结果清楚地表明，哺乳动物的CLPP既不需要，也不调节哺乳动物的UPR（mt）。令人惊讶的是，我们证明由于DARS2缺陷导致的强烈线粒体心肌病和呼吸减少可以通过CLPP的丢失而缓解，从而导致单个OXPHOS亚基的从头合成增加。这些结果质疑了我们目前对哺乳动物UPR（mt）信号的理解，同时引入CLPP作为线粒体疾病治疗干预的新靶点。

关键词：CLPP；DARS2；心肌病；线粒体翻译；线粒体未折叠蛋白反应。

PubMed免责声明

数字

图EV1
图EV1。繁殖计划和控制心脏病理
  1. A类

    繁殖WT、ClpP KO、Dars2 KO和DKO动物的繁殖计划。请注意，ClpP KO和Dars2 KO动物是达累斯2和氯丙烯分别是。等位基因命名：野生型（+）、floxed（L）和转基因（T）。

  2. B–D类

    Dars2 KO小鼠的心脏重量（B）、体重（C）和心体重量比（D）氯磷酸等位基因(n个= 10–14). 条形代表平均值±SEM（学生t吨‐测试****P（P）< 0.0001).

图EV2
图EV2。对照裂解物和分离线粒体中的稳态蛋白质水平
  1. A、 B

    6周龄小鼠心脏线粒体伴侣和蛋白酶及自噬标记p62的Western blot分析：（A）杂合与纯合Dars2 KO氯丙烯背景和（B）杂合与纯合ClpP-KO达累斯2背景。HSC70和Ponceau S染色作为负荷控制。

  2. C类

    分离心脏线粒体中线粒体伴侣、蛋白酶和维持标记物的Western blot分析。

图1
图1。损失CLPP公司缓解心肌病DARS公司2缺乏心脏
  1. A类

    Kaplan–Meier生存曲线(n个= 12–16).

  2. B

    心脏大体形态。

  3. C–E

    （C） 体重、（D）心脏重量和（E）心脏与体重的比率(n个= 28–40).

  4. F类

    心肌肥厚标志物的相对表达水平(Nppa公司和无购买力平价) (n个= 5).

  5. G公司

    COX和SDH活性的酶组织化学双重染色(n个= 4).

  6. H（H）

    Masson三色染色评价心脏纤维化(n个=4）。白色刻度条，100μm；黑色刻度条，1 mm。

数据信息：（C–F）条形代表平均值±SEM（学生t吨‐测试**P（P）<0.01****P（P）< 0.0001).
图2
图2。线粒体和细胞应激反应不依赖于CLPP公司
  1. A、 B

    （A） Western blot分析和（B）UPR的相对定量公吨心脏提取物中的标记物。HSC70用作加载控件（CTRL）(n个= 3).

  2. C、 D类

    相对表达水平归一化为（C）建立的UPR的WT公吨3~4周龄小鼠的标记物和（D）线粒体伴侣、蛋白酶和TFAM(n个= 3–4).

  3. E类

    细胞应激标记物的Western blot分析。HSC70用作加载控制（CTRL）(n个= 3).

  4. F类

    UPR相关转录因子的相对表达水平公吨和ISR（左）以及第21层（右）(n个= 5).

数据信息：（B–D，F）条形代表平均值±SEM（学生t吨‐测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001).
图EV3
图EV3。的相对表达水平UPR（不间断电源） 公吨标记
  1. A、 B

    相对表达水平归一化为（A）建立的UPR的WT公吨标记物和（B）6周龄小鼠的线粒体伴侣、蛋白酶和TFAM(n个= 6).

  2. C、 D类

    相对表达水平归一化为（C）建立的UPR的WT公吨野生型和ClpP-KO HEK293T细胞中的标记物和（D）线粒体伴侣、蛋白酶和TFAM(n个= 6).

  3. E类

    细胞应激标记物的相对量化。HSC70用作加载控制（CTRL）（另请参见图2E）。

数据信息：（A–E）条形代表平均值±SEM（学生t吨‐测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001).
图3
图3。缺乏CLPP公司在里面达尔2型缺陷心脏增加线粒体呼吸活性
  1. A、 B

    （A） 心脏提取物中单个OXPHOS亚基的Western blot分析。HSC70和calnexin用作装载控制(n个= 3). （B） OXPHOS复合物的BN-PAGE和随后的Western blot分析。使用针对单个OXPHOS亚单位的抗体（右侧）检测OXPHOS复合物（左侧）。

  2. C、 D类

    BN‐PAGE后进行的复合物I（C）和IV（D）的凝胶内活性。

  3. E类

    以丙酮酸-谷氨酸-苹果酸（C I）和丙酮酸–谷氨酸-果酸+琥珀酸（C I+C II）为底物时，完整心脏线粒体的耗氧率。状态3（底物+ADP）、状态4（+寡霉素）、未偶联（+FCCP）。(n个  =  3). 条形代表平均值±SEM（学生t吨‐测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).

图EV4
图EV4。线粒体牛津大学控制线粒体裂解物中的复合物
  1. A类

    分离线粒体中单个OXPHOS亚基的Western blot分析。针对单个OXPHS亚基的抗体如左图所示。SDHA和VDAC用作加载控制(n个= 3).

  2. B、 C类

    分离线粒体中OXPHOS复合物的BN‐PAGE和随后的Western blot分析：（B）Dars2 KO与Clpp公司 +/+与。Clpp公司 +/−与。Clpp公司 −/−背景和（C）ClpP KO达累斯2 +/+与。达累斯2 +/−背景。使用针对单个OXPHOS亚单位的抗体（左侧）检测OXPHOS复合物（右侧）。

图4
图4。线粒体蛋白质合成的失调部分通过失去CLPP公司

  1. 代表性凝胶在欧根奈罗心脏线粒体翻译分析。从头开始合成的蛋白质在标记后被分离35S‐Met（1‐h脉冲）或冷追踪（3‐h追踪）后。左侧显示了单个蛋白质的位置。右侧显示了全长蛋白质（精通）和低分子量多肽（流产）的位置。注意，在WT和ClpP KO中，低分子量多肽包括ATP8/ND4L蛋白质。

  2. 相对整体蛋白质合成和周转率。

  3. DARS2水平的Western blot分析。HSC70用作加载控制（CTRL）。

  4. 个人的相对水平从头开始DKO线粒体中合成的OXPHOS亚基标准化为相应的Dars2 KO多肽水平。

  5. 熟练多肽和流产多肽的蛋白质合成的相对水平。

  6. 全长（熟练）人员流动率的量化从头开始合成蛋白质。

数据信息：（B，D–F）条形代表平均值±SEM（学生t吨‐测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001****P（P）< 0.0001) (n个= 3–4).
图EV5
图EV5。线粒体转录和翻译的进一步分析
  1. A、 B

    线粒体翻译率评估在欧根奈罗 35在WT和ClpP KO的分离心脏线粒体中进行10、30和60分钟的S-Met脉冲标记。考马斯亮蓝染色凝胶（A）的放射自显影和代表性部分以及相应的亲属从头开始合成速率曲线（B）(n个= 3).

  2. C类

    考马斯亮蓝染色凝胶的代表性部分，用作图4A的负荷控制。

  3. D类

    代表性密度分析从头开始标记后WT、ClpP KO、Dars2 KO和DKO心脏线粒体中的合成蛋白质，如图4A所示。

  4. E类

    与WT标准化的ClpP-KO、Dars2-KO和DKO心脏中mtDNA编码OXPHOS亚单位的相对表达水平(n个= 5).

  5. F类

    OXPHOS复合物单个OXPHOS亚基（左侧）周转率的Western blot分析（右侧）。WT和ClpP KO小鼠胚胎成纤维细胞在环己酰亚胺（CHX）存在下生长，在指定的时间点后分离蛋白质。

数据信息：（B，E）条形代表平均值±SEM（学生t吨‐测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01).
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