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.2016年6月7日；7(23):34131-48.
doi:10.18632/noctarget.9151。

雌激素相关受体α基因敲除对子宫内膜癌的抗肿瘤作用

松岛浩史 1, 森喜太郎 1, 伊藤富美代克 1, 山本孝郎 1, 秋山真本 1, Tetsuya Kokabu公司 1, Kaori Yoriki先生 1, Umemura村的Shiori 1, 秋叶恭子 1, Jo Kitawaki 1
附属公司

雌激素相关受体α基因敲除对子宫内膜癌的抗肿瘤作用

松岛浩史等。 Oncotarget公司. .

摘要

雌激素相关受体（ERR）α与雌激素受体（ER）α具有结构相似性。然而，它是一种孤儿受体，不与天然雌激素结合。本研究旨在探讨ERRα在子宫内膜癌进展中的作用。对50例子宫内膜癌患者标本的免疫组织化学分析表明，ERRα在所有检测组织中均有表达，ERRβ的表达水平升高与晚期临床分期和浆液组织学类型有关（均p<0.01）。在体外，用siRNA敲低ERRα通过VEGF和细胞增殖抑制血管生成（p<0.01）。流式细胞术和western blot检测细胞周期和凋亡结果表明，ERRα敲除在有丝分裂期诱导细胞周期阻滞，随后由caspase-3启动凋亡。此外，ERRα敲除使细胞对紫杉醇敏感。ERRα敲除异种移植物中也观察到肿瘤生长和血管生成的显著降低（p<0.01）。这些结果表明，ERRα可能是治疗子宫内膜癌的一个新的分子靶点。

关键词：ERRα；血管内皮生长因子；细胞凋亡；细胞周期阻滞；子宫内膜癌。

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利益冲突声明

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数字

图1
图1。子宫内膜癌中ERRα的表达在体外和体内
答：。-C、。ERRα表达与临床病理因素的关系。免疫组织化学检测的ERRα表达水平通过H-核心进行评估，并评估其与临床参数的相关性，包括基于FIGO 2008分类的临床分期答：。，组织病理学类型B。和子宫肌层侵犯C、。显示了。使用Kruskal-Wallis H检验确定统计显著性。使用带有Bonferroni校正的Mann-Whitney U检验作为事后检验。D。Kaplan-Meier分析显示50例子宫内膜癌患者的无病生存率与ERRα表达相关(P（P）=0.03）。P（P）数值基于对数秩检验。E.公司。实时PCR检测子宫内膜癌细胞中ERα、ERRα和PGC-1α（ERRα的共同激活物）的表达。显著差异用**表示P（P）<0.01和*P（P）组间<0.05。
图2
图2。ERRα基因敲除对VEGF表达和血管生成的影响
答：。将含有ERRE位点（5′-AGGTCA-3′）四个拷贝的VEGF启动子荧光素酶报告子转染子宫内膜癌细胞系。B。，荧光素酶转录活性使用VEGF启动子报告。使用脂质体-LTX将pcDNA3.1-ERRα和PGC-1α质粒瞬时转染到HEC-1A和KLE细胞。pcDNA3.1空载体作为阴性对照。转染后，将细胞培养24小时，然后进行裂解。启动子活性通过双荧光素酶分析进行评估。数据代表平均值±SEM(n个= 3).C、。通过实时PCR和western blot分析评估ERRα敲除的效果。数据代表平均值±SEM(n个= 3).D。实时PCR和ELISA检测转染阴性对照（siNC）和ERRα（siERRα）的HEC-1A和KLE细胞中VEGF的表达。转染后，将细胞孵育48小时，然后裂解用于实时PCR，并孵育72小时用于ELISA。数据表示平均值±SEM（实时PCR；n个=3，ELISA；n个= 4).E.公司。采用HUVEC增殖试验评价癌细胞的血管生成潜能。HUVECs与从转染siRNA的子宫内膜癌细胞收集的上清液一起培养。培养72小时后，使用WST-8检测HUVEC的增殖。数据代表平均值±SEM(n个= 4).F、。，Matrigel侵袭试验。HUVEC与转染siRNA的癌细胞在双室系统中共同培养。培养6小时后，评估HUVEC的迁移和侵袭。在三个高倍视野（×200）中计数细胞。数据代表平均值±SEM(n个= 3). 显著差异用**表示P（P）<0.01和*用于P（P）< 0.05. 使用双尾Student t检验进行统计分析。每个分析重复至少三次。人脐静脉内皮细胞；RLU，相对荧光素酶单位。
图2
图2。ERRα基因敲除对VEGF表达和血管生成的影响
答：。将含有ERRE位点（5′-AGGTCA-3′）四个拷贝的VEGF启动子荧光素酶报告子转染子宫内膜癌细胞系。B。，荧光素酶转录活性使用VEGF启动子报告。使用脂质体-LTX将pcDNA3.1-ERRα和PGC-1α质粒瞬时转染到HEC-1A和KLE细胞。pcDNA3.1空载体作为阴性对照。转染后，将细胞孵育24小时，然后裂解。启动子活性通过双荧光素酶分析进行评估。数据代表平均值±SEM(n个= 3).C、。通过实时PCR和western blot分析评估ERRα敲除的效果。数据代表平均值±SEM(n个= 3).D。实时PCR和ELISA检测转染阴性对照（siNC）和ERRα（siERRα）的HEC-1A和KLE细胞中VEGF的表达。转染后，细胞孵育48小时，然后裂解进行实时PCR，孵育72小时进行ELISA。数据表示平均值±SEM（实时PCR；n个=3，ELISA；n个= 4).E.公司。采用HUVEC增殖试验评价癌细胞的血管生成潜能。HUVECs与从转染siRNA的子宫内膜癌细胞收集的上清液一起培养。培养72小时后，使用WST-8检测HUVEC的增殖。数据代表平均值±SEM(n个= 4).F、。，Matrigel侵袭试验。HUVEC与用siRNA转染的癌细胞在双室系统中共同培养。培养6小时后，评估HUVEC的迁移和侵袭。在三个高倍视野（×200）中计数细胞。数据代表平均值±SEM(n个= 3). 显著差异用**表示P（P）<0.01和*P（P）< 0.05. 使用双尾Student t检验进行统计分析。每个分析重复至少三次。人脐静脉内皮细胞；RLU，相对荧光素酶单位。
图3
图3。ERRα敲低对子宫内膜癌细胞增殖的影响
答：。，WST-8细胞增殖试验。siRNA转染后，每24小时测定一次癌细胞的存活率。数据表示平均值±SEM(n个= 4).B。，集落形成分析。siRNA转染后24小时，在6孔板中以3200个细胞/孔的密度重新接种癌细胞，并培养14天。然后用结晶紫染色细胞。C、。，使用流式细胞仪进行细胞周期分析。siRNA转染后24至60小时，收集癌细胞并进行流式细胞术分析。D。，细胞周期各阶段的细胞分布。数据代表平均值±SEM(n个= 3).E.公司。，Sub-G1人群。数据代表平均值±SEM(n个= 3).F、。G2/M期和凋亡相关蛋白的Western blot分析。siRNA转染后24至48小时，使用细胞裂解物进行磷酸化组蛋白H3（Ser10）、CDC2、磷酸化-CDC2（Tyr15）、细胞周期蛋白B1和裂解的胱天蛋白酶-3的蛋白质印迹分析。GAPDH被用作负荷控制。G.公司。G2/M期和亚G1期细胞百分比的时间进程分析。数据代表平均值±SEM(n个= 3). 显著差异用**表示P（P）<0.01和*P（P）< 0.05. 每个分析重复至少三次。siNC，阴性对照siRNA；siERRα，ERRαsiRNA。
图3
图3。ERRα基因敲除对子宫内膜癌细胞增殖的影响
答：。，WST-8细胞增殖试验。siRNA转染后，每24小时测定一次癌细胞的存活率。数据表示平均值±SEM(n个= 4).B。，菌落形成测定。siRNA转染后24小时，在6孔板中以3200个细胞/孔的密度重新接种癌细胞，并培养14天。然后用结晶紫染色细胞。C、。，使用流式细胞仪进行细胞周期分析。siRNA转染后24至60小时，收集癌细胞并进行流式细胞术分析。D。，细胞周期各阶段的细胞分布。数据代表平均值±SEM(n个= 3).E.公司。，Sub-G1人群。数据代表平均值±SEM(n个= 3).F、。G2/M期和凋亡相关蛋白的Western blot分析。siRNA转染后24到48小时，使用细胞裂解物对磷酸化氢istone H3（Ser10）、CDC2、磷酸化CDC2（Tyr15）、cyclin B1和裂解caspase-3进行western blotting分析。GAPDH被用作负荷控制。G.公司。G2/M期和亚G1期细胞百分比的时间进程分析。数据表示平均值±SEM(n个= 3). 显著差异用**表示P（P）<0.01和*P（P）< 0.05. 每个分析重复至少三次。siNC，阴性对照siRNA；siERRα，ERRαsiRNA。
图3
图3。ERRα基因敲除对子宫内膜癌细胞增殖的影响
答：。，WST-8细胞增殖试验。siRNA转染后，每24小时测定一次癌细胞的存活率。数据表示平均值±SEM(n个= 4).B。，集落形成分析。siRNA转染后24小时，在6孔板中以3200个细胞/孔的密度重新接种癌细胞，并培养14天。然后用结晶紫对细胞进行染色。C、。，使用流式细胞仪进行细胞周期分析。siRNA转染后24至60小时，收集癌细胞并进行流式细胞术分析。D。，细胞周期各阶段的细胞分布。数据代表平均值±SEM(n个= 3).E.公司。，Sub-G1人群。数据代表平均值±SEM(n个= 3).F、。G2/M期和凋亡相关蛋白的Western blot分析。siRNA转染后24到48小时，使用细胞裂解物对磷酸化氢istone H3（Ser10）、CDC2、磷酸化CDC2（Tyr15）、cyclin B1和裂解caspase-3进行western blotting分析。GAPDH被用作负荷控制。G.公司。G2/M期和亚G1期细胞百分比的时间进程分析。数据代表平均值±SEM(n个= 3). 显著差异用**表示P（P）<0.01和*P（P）< 0.05. 每次测定至少重复三次。siNC，阴性对照siRNA；siERRα，ERRαsiRNA。
图4
图4。ERRα基因敲除对子宫内膜癌细胞对抗癌药物敏感性的影响
答：。和B。，使用WST-8分析对抗癌药物的敏感性。siRNA转染后24小时，用DMSO（对照）、紫杉醇处理细胞答：。或顺铂B。以指示的浓度。48小时后，用WST-8测定细胞活力。数据代表平均值±SEM(n个= 4).C、。，1.5 nM紫杉醇致敏作用的时间过程分析。siRNA转染后24小时，用二甲基亚砜或1.5 nM紫杉醇处理细胞。然后每24小时使用WST-8分析评估细胞活力。数据表示平均值±SEM(n个= 4). 4 4显著差异用**表示P（P）<0.01和*P（P）< 0.05. 每个分析重复至少三次。siNC，阴性对照siRNA；siERRα，ERRαsiRNA。
图5
图5。ERRα基因敲除对子宫内膜癌细胞增殖和血管生成的影响体内使用小鼠异种移植模型
答：。,体内肿瘤生长分析。HEC-1A细胞（每只小鼠5×106个细胞）通过皮下注射接种到小鼠背部。然后在指定的日期（箭头所示），向小鼠局部注射1000 pmol的对照组（蓝色方框）或ERRαsiRNA（橙色圆圈）。每周测量两次肿瘤体积。数据表示平均值±SD(n个= 5).B。，每组切除肿瘤的图像和重量。C、。TUNEL检测肿瘤切片中的凋亡细胞。凋亡指数定义为10个高倍视野（×400）中免疫阳性细胞的百分比。数据表示平均值±SD。D。用抗CD31抗体标记微血管。在低功率场（×40）下选择致密区的微血管。使用ImageJ软件在高倍物镜（×200）下计算每个显微视野的CD31免疫阳性像素。微血管密度定义为10种不同视图中每高倍视野（×200）CD31免疫阳性像素的百分比，并在肿瘤的中心和边缘区域进行比较。数据表示平均值±SD。显著差异用**表示P（P）<0.01和*P（P）< 0.05. siNC，阴性对照siRNA；siERRα、ERRαsiRNA；TUNEL，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记。
图5
图5。ERRα基因敲除对子宫内膜癌细胞增殖和血管生成的影响体内使用小鼠异种移植模型
答：。,体内肿瘤生长分析。HEC-1A细胞（每只小鼠5×106个细胞）通过皮下注射接种到小鼠背部。然后在指定的天数（箭头）给小鼠局部注射1000pmol的对照（蓝色方框）或ERRαsiRNA（橙色圆圈）。每周测量两次肿瘤体积。数据表示平均值±SD(n个= 5).B。，每组切除肿瘤的图像和重量。C、。TUNEL检测肿瘤切片中的凋亡细胞。凋亡指数定义为10个高倍视野（×400）中免疫阳性细胞的百分比。数据表示平均值±SD。D。用抗CD31抗体标记微血管。在低功率场（×40）下选择致密区的微血管。使用ImageJ软件在高倍物镜（×200）下计算每个显微视野的CD31免疫阳性像素。微血管密度定义为10个不同视图中每个高倍视野（×200）CD31免疫阳性像素的百分比，并在肿瘤的中央和边缘区域进行比较。数据表示平均值±SD。显著差异用**表示P（P）<0.01和*用于P（P）< 0.05. siNC，阴性对照siRNA；siERRα、ERRαsiRNA；TUNEL，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记。
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