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.2016年5月5日5:7:11498。
doi:10.1038/ncomms11498。

边缘区B细胞通过Fcα/μR偶联TLR4信号诱导的白细胞介素-6分泌加重内毒素休克

本田信一郎 1, 佐藤和树 1, 名古屋Totsuka 1, 藤山佐治 1, 藤本万寿 2, 三宅贤介 三, Chigusa Nakahashi-Oda公司 1, 佐藤·塔哈拉·哈纳奥卡 1 4, 涉谷株式会社 1, 涩谷明 1 4
附属公司

边缘区B细胞通过Fcα/μR偶联TLR4信号诱导的白细胞介素-6分泌加重内毒素休克

本田信一郎等。 国家公社. .

摘要

边缘区（MZ）B细胞产生第一波抗体，以保护其免受血源性病原体的侵袭。然而，MZ B细胞在炎症反应中的作用尚未阐明。在这里，我们发现MZ B细胞产生促炎细胞因子，如白细胞介素-6（IL-6），并加剧对脂多糖（LPS）的全身炎症反应。与野生型小鼠相比，静脉注射LPS或大肠杆菌后，缺乏MZ B细胞或仅缺乏MZ B-细胞IL-6的小鼠可减轻全身炎症反应并延长生存期。LPS通过Toll样受体4（TLR4）和MyD88途径直接刺激MZ B细胞产生IL-6。此外，TLR4需要与Fcα/μR（CD351）的物理和功能关联，以形成其低聚物、NF-κB信号和MZ B细胞产生IL-6；这种联系与全身炎症反应和内毒素休克有关。这些结果揭示了MZ B细胞在内毒素休克中的促炎作用。

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数字

图1
图1。MZ B细胞有助于对抗内毒素休克的炎症反应。
(一)生成缺乏MZ B细胞的小鼠（ΔMZ B）或对照小鼠（MZ B-WT）的策略。致死性辐射小鼠按指定比例静脉注射WT和CD19-缺陷小鼠的混合骨髓细胞。(b条)脾细胞流式细胞术。显示了B细胞群中MZ B细胞的百分比。(c（c）)用酶联免疫吸附试验测定小鼠血清中的天然IgM。(d日,电子)ΔMZ B或MZ B-WT小鼠静脉注射LPS。然后分析小鼠血清AST水平12 CLP后h(d日)并监测小鼠的存活率(电子). 数据是三个独立实验的代表。为了进行生存分析，将每个实验的数据汇总在一起，并显示小鼠总数。对未配对学生的t吨-测试。小鼠存活采用对数秩检验。误差线表示s.d.NS，不显著。
图2
图2。内毒素休克时MZ B细胞分泌细胞因子和趋化因子。
(一,b条)MZ B细胞（MZ B）和巨噬细胞（M⁄）(一)，或脾细胞总数（灰色）和脾细胞耗尽的MZ B细胞（黑色）或巨噬细胞（白色）(b条)在注射LPS后的指定时间点，从C57BL/6小鼠中纯化LPS，并通过定量RT-PCR分析指示的细胞因子和趋化因子。(c（c）)通过酶联免疫吸附试验测定注射LPS后指定时间点从ΔMZ B小鼠血清中获得的IL-6和CXCL10。数据是三个独立实验的代表。对未配对学生的t吨-测试。误差条表示s.d.NS，不显著。
图3
图3。来自MZ B细胞的IL-6加剧了对内毒素休克的全身炎症反应。
(一——c（c）)生成MZ B细胞（MZ B-IL6-KO）中缺乏IL-6的小鼠或对照小鼠（MZ B-WT）的策略。致死性照射小鼠静脉注射WT或IL-6缺陷小鼠和CD19-缺陷小鼠的混合骨髓细胞，注射比例显示(一). 分析脾细胞中MZ B细胞在B220中的比例+流式细胞术检测细胞数量(b条). 通过流式细胞术4纯化MZ B细胞、滤泡（FO）B细胞和巨噬细胞 LPS注射后h，分析伊尔6通过定量RT-PCR(c（c）). (d日——（f）)分析MZ B-WT和MZ B-IL6-KO的血清IL-6和CXCL10水平(d日)在指定的时间点和AST(电子) 12 注射LPS后h，监测存活率(（f）). 数据代表至少两个独立实验。对于小鼠存活率，将每个实验的数据汇总在一起，并显示小鼠总数。对未配对学生的t吨-测试。小鼠存活采用对数秩检验。误差线表示s.d.NS，不显著。
图4
图4。抗IL-6R中和IL-6可防止LPS引起的内毒素休克。
(一)内毒素休克抗体注射的实验程序。(b条——克)将抗IL-6R抗体或对照抗体静脉注射到C57BL/6小鼠4 之后h(b条——d日)或1 LPS挑战前h(电子——克). 分析小鼠血清CXCL10水平(b条,电子)和直肠温度(c（c）,（f）)12个 注射LPS后h，监测存活率(d日,克)注射LPS后。数据代表至少两个独立实验。对于小鼠存活率，将每个实验的数据汇总在一起，并显示小鼠总数。对未配对学生的t吨-测试。小鼠存活采用对数秩检验。误差线表示s.d.NS，不显著。抗体；续，控制；温度。
图5
图5。LPS直接刺激MZ B细胞产生IL-6。
(一)静脉注射LPS给WT小鼠和TRIF或MyD88缺陷小鼠。伊尔6在从指定小鼠纯化的MZ B细胞中的表达4 LPS注射后h用定量RT-PCR（qRT-PCR）检测。(b条)从WT或MyD88缺陷小鼠纯化的MZ B细胞在有或无LPS的条件下培养24小时 h，然后通过ELISA分析IL-6的产生。(c（c）,d日)用WT（CD45.1）和TLR-4缺陷型（CD45.2）MZ B细胞转移WT小鼠（CD45.2%）。20小时后，向小鼠注射LPS，然后转移WT（CD45.1），并通过流式细胞术4纯化TLR-4缺陷的MZ-B细胞 LPS注射后h，分析伊尔6通过qRT–PCR。(电子,（f）)用从C3H/HeJ或C3H/HeN小鼠纯化的MZ B细胞转移C3H/HeJ小鼠。20小时后，给小鼠注射LPS，并分析血清IL-6水平4 ELISA法检测LPS注射后h。对未配对学生的t吨-测试。误差线表示s.d.NS，不显著。
图6
图6。Fcα/μR与TLR4相关，并放大LPS诱导的信号级联。
(一)从WT或Fcα/μR缺陷小鼠纯化的MZ B细胞或FO B细胞在有或无LPS的条件下培养24小时 h，然后通过ELISA分析IL-6的产生。(b条,c（c）)稳定表达TLR4的Ba/F3细胞与GFP（TLR4G）、标记TLR4（TLR4]）、标记MD-2（MD2F）和CD14融合，并伴有或不伴有跨膜区突变的HA标记WT Fcα/μR（HA-Fcα/？？？？WT）或Fc或细胞质部分（HA-Fcα/μRΔCyt）用抗-HA免疫沉淀，然后用抗Flag或抗-HA进行免疫印迹。(d日,（f）)用LPS刺激或不刺激稳定表达TLR4F、TLR4G、MD2F、CD14或表达这些转导蛋白的Ba/F3细胞，并用抗Flag抗体进行免疫沉淀(d日)或者不是(（f）)然后用抗GFP免疫印迹(d日)，反Flag(d日)，抗IκBα(（f）)或抗β-肌动蛋白(（f）). (电子)从WT或Fcα/μR缺陷小鼠中纯化MZ B细胞，并进行近端结扎试验（PLA），以分析Fcα/μR和TLR4的相关性。用荧光显微镜分析PLA信号。(克)从WT或Fcα/μR缺陷小鼠纯化的MZ B细胞经LPS刺激或不刺激，并用抗IκBα或抗β-肌动蛋白进行免疫印迹。该图显示了每个波段的密度动力学。数据是三个独立实验的代表。对未配对学生的t吨-测试。误差条表示s.d.IB，免疫印迹；免疫沉淀；NS，不显著。
图7
图7。MZ B细胞上的Fcα/μR增强全身炎症反应。
(一,b条)在MZ B细胞（MZ B-Fcα/μR-KO）或对照小鼠（MZ B-WT）中生成缺乏Fcα／μR的小鼠的策略。经致命照射的小鼠接受静脉注射WT或Fcα/μR缺陷小鼠和CD19-缺陷小鼠的混合骨髓细胞，注射比例显示(一). 用流式细胞术分析从MZ B-WT或MZ B-Fcα/μR-KO小鼠中纯化的MZ B细胞、FO B细胞和巨噬细胞（MüFcamr公司通过定量RT-PCR(b条). (c（c）——电子)向MZ B-WT或MZ B-Fcα/μR-KO小鼠注射LPS，然后分析血清IL-6和CXCL10 4和8水平 注射LPS后h(c（c）)，AST 12 注射LPS后h(d日)并监测存活率(电子). 数据代表至少两个独立实验。对于小鼠存活率，将每个实验的数据汇总在一起，并显示小鼠总数。对未配对学生的t吨-测试。小鼠存活采用对数秩检验。误差线表示s.d.NS，不显著。
图8
图8。抗IL-6R对IL-6的中和作用通过大肠杆菌注入。
(一,b条)向缺乏MZ B细胞的小鼠（ΔMZ B小鼠）或对照小鼠（MZ B-WT）注射大肠杆菌并监测存活率(一)并分析了直肠温度12 之后h大肠杆菌注入(b条). (c（c）——电子)向小鼠静脉注射抗IL-6R抗体或对照抗体2 之后h大肠杆菌注入(c（c）)并监测存活率(d日)并对直肠温度进行了分析(电子) 12 注射LPS后h。将每个实验的数据汇总在一起，并显示小鼠总数。对未配对学生的t吨-测试。小鼠存活采用对数秩检验。误差条表示s.d.Ab，抗体；续，控制；NS，不显著；温度。
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