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.2016年7月；22(7):995-1010.
doi:10.1261/rna.055830.115。 Epub 2016年5月4日。

RNA配对蛋白调节长非编码RNA HOTAIR的活性

艾米莉·梅雷迪斯 1, 玛姬·巴拉斯 2, 卡拉·辛迪 1, 克里斯托尔·海斯洛普 1, 亚伦·M·约翰逊 2
附属公司

RNA配对蛋白调节长非编码RNA HOTAIR的活性

艾米莉·梅雷迪斯等。 核糖核酸. 2016年7月.

摘要

人类长非编码RNA（lncRNA）HOTAIR通过反式作用将Polycomb抑制复合物2（PRC2）招募到HOXD基因簇中，并在发育过程中促进基因沉默。在乳腺癌中，HOTAIR的过度表达通过抑制许多其他基因增加了转移潜能。目前尚不清楚是什么因素决定了特定基因组位点上HOTAIR依赖的PRC2活性，特别是当高水平HOTAIR导致异常基因沉默时。为了确定有助于HOTAIR特异作用的其他蛋白质，我们对HOTAIR相互作用组进行了定量蛋白质组学分析。我们发现，HOTAIR与异质核核糖核蛋白（hnRNP）A2/B1之间的相互作用最为特异，后者是参与新生mRNA加工和RNA匹配的蛋白质家族成员。我们的数据表明，A2/B1是HOTAIR介导的乳腺癌细胞染色质调节的关键因素：A2/B1敲除减少HOTAIR依赖性乳腺癌细胞的侵袭，并降低大多数HOTAIR相关位点的PRC2活性。我们发现，B1亚型与A2不同的是有12个额外的氨基酸，它与HOTAIR结合具有最高的特异性。B1还结合染色质，并优先与HOTAIR基因靶点的RNA转录物结合。我们进一步证明了HOTAIR和靶转录物之间的直接RNA-RNA相互作用，这种作用通过B1结合增强。总之，这些结果表明了一个模型，其中B1将HOTAIR与染色质上目标基因的转录物相匹配，从而导致PRC2的抑制。

关键词：热空气；多梳抑制复合物2（PRC2）；RNA配对；染色质；长非编码RNA。

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数字

图1。
图1。
SILAC质谱鉴定与HOTAIR特异性相互作用的蛋白质。(A类)体外转录物用MS2 RNA适配体3′标记，与标记的核提取物孵育，并通过与直链淀粉树脂结合的融合蛋白MS2-MBP回收。结合与转录物稳定相关的蛋白质并进行LC/MS(B类)使用MaxQuant计算从HeLa核提取物中回收的蛋白质在HOTAIR和抗-Luc样品中的富集度。绘制了所有已识别蛋白质的比率。(C类)HeLa核提取物中HOTAIR相互作用蛋白的蛋白质印迹验证。抗-Luc和反义HOTAIR序列的体外转录物用作阴性对照（来自同一印迹的所有通道）。hnRNP K作为阴性对照蛋白。(天)A2和B1蛋白质的示意图，其区别仅在于外显子2编码的独特B1 N末端结构域。(E类)通过Western blot分析从HeLa核提取物中提取的HOTAIR RNA中B1对A2的富集。该图描述了B1与A2的平均±SD比率(n个=3，双尾t吨-测试）。
图2。
图2。
hnRNP B1的RNA免疫沉淀可恢复HOTAIR。(A类)西方分析表明，在MDA-MB-231细胞中通过B1特异性抗体分离出B1亚型而不是A2亚型。(B类)在HOTAIR过度表达MDA-MB-231细胞中，hnRNP B1与IgG对照RIP后，通过RT-qPCR评估HOTAIR、7SL和GAPDH RNA的恢复。该图描绘了平均回收率±SD（双尾t吨-测试，n个= 4). (C类)对只表达内源性HOTAIR的MCF-7细胞进行hnRNP B1 RIP和IgG对照后，通过RT-qPCR评估HOTAIR、7SL和GAPDH RNA的恢复。该图描述了平均回收率±SD（双尾t吨-测试，n个= 4).
图3。
图3。
HOTAIR介导的迁移和入侵需要hnRNP A2/B1。(A类)西方分析证实了MDA-MB-231中A2和B1的敲除。图中显示了两个复制品的敲除定量，每个复制品都使用加载控制进行了标准化。(B类)使用每个细胞系的三个生物复制品，在6小时后量化MDA-MB-231细胞通过Matrigel的侵袭。对于每一次复制，使用ImageJ软件从6个10×场中对侵入Matrigel并通过腔室孔的细胞进行计数。图表显示了三个重复实验（双尾t吨-用于计算的测试P（P）-值）。入侵的典型图像见补充图S3B. (C类)6小时后，对MDA-MB-231细胞通过8-µm孔的迁移进行量化。图中显示了平均迁移细胞±SD（双尾t吨-用于计算的测试P（P）-值，n个= 3). (天)Western blot证实了MCF-7细胞中A2和B1的敲除（shA2B1-1用于MDA-MB-231细胞中的敲除）。肌动蛋白被用作加载控制。该图描述了两个重复±SD的平均敲除的Western blot定量(E类)使用每个细胞系的三个生物复制品，在6小时后量化MCF-7细胞通过8-µm孔的迁移。该图显示了平均迁移细胞±SD(P（P）-从双尾函数导出的值t吨-测试与shNon-Target控制，n个= 3).
图4。
图4。
hnRNP A2/B1调节HOTAIR依赖型H3K27me3。(A类)H3K27me3的ChIP或HOTAIR靶基因的IgG。qPCR用于评估HOTAIR靶点的富集情况。GAPDH被用作控制位点。条形图描述了回收的平均输入%±SEM(n个H3K27me3抗体=6；n个IgG=2；P（P）-单尾值t吨-测试抗-Luc表达细胞。(纳秒)无重大变化(P（P）> 0.05). (B类)用四种MDA-MB-231细胞系中的每一种进行H3K27me3 ChIP-seq(n个=每行2个）。(C类)热图描述了HOTAIR增加H3K27me3的434个区域的归一化信号积累（大于增加的两倍，FDR<0.01）。通过计算Z轴-每个样本的得分。(天)箱线图描绘了434个HOTAIR调节基因座的平均H3K27me3信号积累(顶部)以及在四个细胞系中任何一个显示H3K27me3高于背景的所有位点(底部). 箱线图表明，HOTAIR介导的H3K27me3增加仅限于一部分基因座，并且HOTAIR shA2/B1细胞未显示H3K17me3的整体减少。P（P）-值来自于双尾t吨-在HOTAIR和HOTAIR sh A2/B1样本之间进行测试，使用每个位点H3K27me3的归一化累积。
图5。
图5。
HnRNP B1定位于染色质，并优先与HOTIAR相互作用。(A类)HOTAIR靶基因B1的ChIP和用异形特异性抗体控制的GAPDH。IgG被用作阴性对照抗体。图表显示恢复的平均输入%±SD(n个= 2). (B类)用于染色质重建的生物素化DNA模板。六个串联LexA结合位点允许RNA将转录物连接到染色质或裸DNA。(C类)重组人染色质通过酶组装产生，并通过微球菌核酸酶消化证实。(天)用HeLa细胞的核提取物孵育含有HOTAIR或抗-Luc体外转录物的裸DNA或染色质。使用pan-A2/B1抗体进行西方分析，以确定B1和A2对染色质和裸DNA底物的补充水平。hnRNP K是一种丰富的hnRNP蛋白，用作阴性对照。RNA连接的效率和MDA-MB-231细胞的其他结果见补充图S5D，E.
图6。
图6。
hnRNP B1与HOTAIR靶基因的RNA转录物结合，增强HOTAIR–RNA相互作用。(A类)过度表达HOTAIR的MDA-MB-231细胞中B1与IgG的天然RNA免疫沉淀。RT-qPCR用于评估HOTAIR靶RNA转录物与一组对照RNA的富集情况。图中显示了恢复的平均输入百分比±SD(P（P）-双尾值t吨-测试与IgG，n个= 2). （*）表示qRT-PCR无法检测到信号的IgG样本。输入样本中未检测到HOXD10 RNA。(B类)RNA–IntaRNA预测的HOTAIR和JAM2之间的RNA相互作用（Wright等人，2014）。RNA-RNA相互作用实验示意图如下在下面.RAT标记的JAM2与HOTAIR或抗-Luc对照RNA在有无B1的情况下孵育，然后通过蛋白链纯化。(C类)通过RT-qPCR定量HOTAIR和抗Luc RNA与JAM2的关联(n个=3，图表显示平均值±SD）。“仅HOTAIR”表示没有JAM2 RNA的分析(天)HOTAIR全长转录物中预测的JAM2相互作用区域被删除或突变，并通过RT-qPCR评估HOTAIR与JAM2的关联。该图描述了两个突变转录物相对于野生型HOTAIR序列的平均恢复±SD(n个= 3,P（P）-值表示双尾t吨-纳克WT与突变HOTAIR的测试恢复）。HOTAIR恢复被归一化为JAM2转录本的恢复（有关更多详细信息，请参阅材料和方法）。(E类)通过RT-qPCR评估在B1蛋白缺失和存在的情况下JAM2和HOTAIR的恢复情况。图表描述了四个生物复制的平均值±SD(P（P）-双尾值t吨-测试）。(F类)作为HOTAIR和HOTAIR靶基因转录物的媒人的B1模型，促进随后的PRC2活性。
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