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.2016年6月14日；133(24):2447-58.
doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.116.021494。 Epub 2016年4月25日。

内皮细胞和造血细胞中脯氨酸-4羟化酶2（PHD2）缺乏通过低氧诱导因子-2α诱导小鼠和人闭塞性血管重塑和严重肺动脉高压

戴志宇 1, 李明（音） 1, 约翰·沃顿 1, 玛姬·M·朱 1, 赵友阳 2
附属公司

内皮细胞和造血细胞中的脯氨酸-4羟化酶2（PHD2）缺乏通过缺氧诱导因子-2α诱导小鼠和人类闭塞性血管重塑和严重肺动脉高压

戴志宇等。 循环. .

摘要

背景：血管闭塞和复杂的丛状病变是患者严重肺动脉高压（PAH）病理学的特征。然而，闭塞性血管重塑的机制尚不清楚；因此，目前的治疗方法并没有针对基本的疾病改善机制，导致发病率和死亡率只有适度的改善。

方法和结果：Tie2预介导内皮细胞和造血细胞Egln1（编码脯氨酸-4羟化酶2[PHD2]；Egln2））断裂的小鼠表现出自发性重度PAH，伴有广泛的肺血管重塑，包括血管闭塞和丛状病变，类似于临床PAH病理学的特征。正如在特发性PAH患者中所见，Egln1（Tie2）小鼠表现出前所未有的右心室肥厚和衰竭，以及渐进性死亡率。在特发性PAH患者中，肺血管闭塞的肺内皮细胞中PHD2的表达持续减少。Egln1和Hif1a或Egln1-Hif2a的基因缺失确定低氧诱导因子-2α是Egln1-（Tie2）小鼠严重PAH的关键介质。我们还观察到Egln1（Tie2）肺中许多肺动脉高压致病基因的表达发生改变，Egln1/Hif2a（Tie1）肺中的表达正常。PHD2缺陷内皮细胞部分通过低氧诱导因子-2α激活的CXCL12表达促进平滑肌细胞增殖。Cxcl12基因缺失可减弱Egln1（Tie2）小鼠体内的PAH。

结论：这些研究确定了PHD2缺乏在严重PAH机制中的意外作用，并确定了第一个具有闭塞性血管重塑和病理生理学概括临床PAH的转基因小鼠模型。因此，针对PHD2/低氧诱导因子-2α信号转导是治疗重度PAH逆转血管重构的一种有希望的策略。

关键词：内皮细胞；丛状病变；肺心病；肺动脉高压；右心肥大和衰竭；血管重塑；血管平滑肌细胞。

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数字

图1
图1
自发性重度多环芳烃Egln1号机组铁2老鼠。（A–D）铁2Cre介导的Egln1号机组在肺ECs中。显示生成策略的图表Egln1号机组铁2老鼠(A类). 具有代表性的Western blotting显示，分离自Egln1号机组铁2肺与WT的比较(B类). 实验用相似的数据重复了两次。QRT-PCR分析证明PHD2缺失Egln1号机组铁2肺内皮细胞而非成纤维细胞（Fib）(C类). 数据表示为平均值±SD（n=3）（C）。免疫染色的代表性显微照片显示EC-特异性PHD2破坏Egln1号机组铁2小鼠肺部。肺组织用抗PHD2和抗CD31（EC标记物）联合染色。用DAPI对细胞核进行复染。PHD2在肺血管内皮细胞中的表达减少，但在Egln1号机组铁2肺。请注意Egln1号机组铁2肺部。Br，细支气管；五、 容器。比例尺，50µm(D类). CKO公司=出口1铁2. (E类)代表性RVSP轨迹（每个=1s）。(F类)年RVSP大幅增加Egln1号机组铁2老鼠。条形代表平均值。(G公司)明显的右心室肥大Egln1号机组铁2老鼠。**，P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001（学生的t吨测试：C类; 双向方差分析然后是Games-Howell事后分析：F类和G公司).
图2
图2
严重RV肥大和衰竭以及Egln1号机组铁2老鼠。（A）典型的超声心动图显示右心室室扩大和右心室壁增厚Egln1号机组铁2小鼠（3.5个月龄）。（B–E）超声心动图显示收缩期末（ES）和舒张末期（ED）RV室扩大(B类); 右心室壁厚度舒张增加（RVWTD）(C类); 右心室部分面积变化（RVFAC）减少，表明右心室收缩力降低(D类); PA AT/ET比率降低(E类)英寸Egln1号机组铁2小鼠（3.5个月大）。数据表示为平均值±SD（n=5 WT和6Egln1号机组铁2). (F类)QRT-PCR分析显示右心室胚胎基因程序重新激活出口1铁23.5个月龄的小鼠，表明存在心力衰竭。ANF=心钠素；sk-actin=骨骼α-actin。(G公司). 累进死亡率出口1铁2老鼠。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001. 学生的t吨测试(B-E公司)，韦尔奇t吨测试(F类)和log-rank（Mantel-Cox）测试(G公司)用于统计分析。
图3
图3
衰减的PAH出口1铁2用WT骨髓细胞重建嵌合小鼠。(A类)一幅漫画显示骨髓（WT或CKO-BM）移植到受致命辐射的WT小鼠。(B类)QPCR分析斯里序列（Y染色体特异基因）显示雌性受体WT小鼠与雄性受体WT鼠骨髓重建效率高于95%Egln1号机组铁2骨髓。取雄性WT小鼠骨髓DNA作为阳性对照。(C、 D类)致死性照射WT小鼠骨髓细胞的重建Egln1号机组铁2小鼠（CKO-BM）对RVSP无影响(C类)和RV/LV+S比率(D类). 作为对照，将WT骨髓细胞移植到WT受体小鼠。(E-G公司)Egln1号机组铁2用WT骨髓细胞重建的嵌合体小鼠表现出RVSP和RV肥大的显著降低，P（P）<0.001（学生的t吨测试）。CKO公司=Egln1号机组铁2.
图4
图4
闭塞性肺血管重塑出口1铁2老鼠。(A类)Russel-Movat五铬染色的代表性显微照片显示，3.5个月大的婴儿内膜、中层和外膜增厚，大小血管闭塞（黑色箭头）和丛状病变（红色箭头）Egln1号机组铁2小鼠（n=3只体重和6只Egln1号机组铁2老鼠）。Br，支气管；五、 容器。比例尺：50µm。(B类)抗CD31免疫组化显示内皮标记物CD31阳性的多通道病变（箭头）。比例尺：50µm。(C类)肺血管重塑的量化Egln1号机组铁2老鼠。1级（G1），内侧肥大；G2，中间肥大和内膜增厚（部分闭塞）；G3，闭塞性病变（>75%闭塞）；G4，丛状病变。发现严重的肺血管重塑Egln1号机组铁23.5个月龄小鼠与1.5个月龄的小鼠相比。总计=量化的所有血管（n=280条/组，n=5只/组）。3.5个月前Egln1号机组铁2小鼠，丛状病变（G4）主要见于大血管（直径>100µm），而闭塞病变（G3）则主要见于小血管。(D-F公司)肺血管病变中显示反光滑肌肉α-肌动蛋白（α-SMA）、抗FSP1或CD11b染色的典型显微照片Egln1号机组铁2老鼠。支气管；五、 容器。比例尺，50µm。(G公司)肺血管病变中增殖的内皮细胞、平滑肌细胞和外膜细胞的典型显微照片Egln1号机组铁2小鼠（3.5个月龄）。肺切片用抗Ki67抗体进行细胞增殖免疫染色，用抗CD31抗体进行内皮细胞免疫染色。箭头指向不断增殖的EC；箭头表示SMC增殖；开放箭头表示外膜细胞增殖。比例尺，50µm。(H（H）)Western blotting显示PCNA表达增加，PCNA是细胞增殖的标志物Egln1号机组铁2肺。
图5
图5
IPAH患者阻塞性肺血管中PHD2表达减弱。(A类)免疫染色显示IPAH肺闭塞血管（箭头）管腔中PHD2表达减弱（红色）。肺切片显示出强烈的自体荧光（AutoF），这有助于显示形态学。箭头指向非闭塞血管；星号表示血细胞。比例尺，50µm。(B类)PHD2表达的量化。免疫荧光强度（Fluo）分级为1至10，最高为10。IPAH患者闭塞血管中PHD2表达减少。数据表示为平均值±标准偏差**，P（P）<0.01（韦尔奇t吨测试）。A.U.，任意单位。
图6
图6
HIF-2α活化在Egln1号机组铁2小鼠介导严重PAH。(A类)Western blot显示HIF-1α和HIF-2α在Egln1号机组铁2小鼠肺部。实验用相似的数据重复了两次。(B-D公司)的基因缺失HIF2α但不是HIF1α在里面Egln1号机组铁2小鼠RVSP完全正常(C类)并通过归一化RV/LV+S比率（2个月大）明显抑制RV肥大。(D类)条形代表平均值。(E、 F类)超声心动图显示RVWTD正常化(E类)和PA AT/ET比率(F类)英寸EH2型3.5个月龄的小鼠。数据表示为平均值±SD（n=6 WT，8出口1铁2和5EH2型). (G公司)Russel-Movat五色染色显示肺血管结构正常EH2型3.5个月大的小鼠与出口1铁2老鼠。Br，细支气管；五、 容器。比例尺：50µm。(H（H）)典型的显微照片显示Egln1号机组铁2小鼠和正常化EH2型3.5个月龄的小鼠。肺切片用抗平滑肌α-肌动蛋白（SMA）（红色）进行免疫染色。箭头指向肌肉化的远端血管。比例尺，50µm。(我)肌肉化量化。在每个肺切片的40个区域（×200）计数SMA阳性血管。数据表示为平均值±SD（n=5只小鼠/组）。*，P（P）< 0.05; ***,P（P）< 0.001.方差分析然后采用Games-Howell事后分析进行统计分析。
图7
图7
与各种PH动物模型相关的基因表达谱。(A类)WT中RNA-seq分析的代表性热图，Egln1号机组铁2（CKO）和EH2型小鼠肺（n=3只/组）。(B-D公司)HIF-α靶基因的RNA-seq分析(B类)，PH-causing基因(C、 D类)在小鼠肺部。(E类)显示Cxcl12表达增加的代表性图表出口1铁2肺，而在EH2型通过RNA-seq分析确定肺部。(F类)已发表PH动物模型中已知上调基因表达的QRT-PCR分析。数据表示为平均值±标准差（n=4 WT、6 CKO和6EH2型). (G公司)PH动物模型中已知下调基因表达的QRT-PCR分析，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.方差分析然后采用Games-Howell事后分析进行统计分析。
图8
图8
HIF-2α介导的CXCL12在肺内皮细胞中的诱导可诱导SMC增殖，并导致严重的肺动脉高压Egln1号机组铁2老鼠。（A）QRT-PCR分析证明PHD2缺陷内皮细胞中CXCL12的诱导依赖于HIF-2α。将PHD2、HIF1A或HIF2A特异的小干扰RNA转染到人肺微血管内皮细胞。抗PHD2的干扰RNA也被转染作为对照。数据表示为平均值±SD（n=3）。(B类)典型的显微照片显示PHD2缺陷内皮细胞通过Transwell共培养系统诱导SMC增殖。用抗BrdU抗体（绿色）对增殖的SMC进行免疫染色。比例尺，50µm。(C类)定量显示PHD2缺陷内皮细胞诱导SMC增殖显著增加，而CXCL12的敲除部分抑制了SMC增殖。n=3。(D类)QRT-PCR分析证明siRNA介导的人肺内皮细胞CXCL12的敲除。(E类)Cxcl12的表达在Egln1号机组铁2（CKO）肺以HIF-2α而非HIF-1α依赖的方式存在。肺组织取自1.5个月大的小鼠。(F类)两种基因均缺失的小鼠模型的建立Egln1号机组和Cxcl12号机组（ECx）。(G公司)ECx小鼠与CKO小鼠（3.5月龄）相比，RVSP显著降低。(H（H）)ECx小鼠的RV肥大也被部分抑制。**，P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.方差分析然后使用Games-Howell事后分析进行统计分析(A、 C、E). 学生的t吨测试用于统计分析(D、 G、H). (我)图示ECs和HCs中PHD2缺乏导致闭塞性肺血管重塑和严重PAH的模型。内皮细胞PHD2缺乏对PAH的发展至关重要，而HCs中PHD2的缺乏会加重疾病的严重程度。通过HIF-2α的激活，PHD2缺乏诱导小鼠肺中多种信号通路的失调，这些信号通路可能共同作用以诱导严重的肺血管重塑，包括血管闭塞和丛状病变的形成以及血管收缩，从而导致严重的PAH和RV衰竭。
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