A Contra Capture Protein Array Platform for Studying Post-translationally Modified (PTM) Auto-antigenomes

doi:10.1074/mcp.M115.057661

.2016年7月；15(7):2324-37.

doi:10.1074/mcp。M115.057661。 Epub 2016年5月2日。

用于研究翻译后修饰（PTM）自身抗基因组的反捕获蛋白质阵列平台

附属公司

¹来自亚利桑那州立大学个性化诊断中心生物设计研究所，亚利桑纳州坦佩市，邮编：85287；
²§Engineering Arts LLC，亚利桑那州凤凰城，邮编85076；
^三来自亚利桑那州立大学个性化诊断中心生物设计研究所，亚利桑纳州坦佩市，邮编：85287；§Engineering Arts LLC，亚利桑那州凤凰城，邮编85076；
⁴¶华盛顿州西雅图贝纳罗亚研究所，邮编：98101。
⁵来自亚利桑那州立大学个性化诊断中心生物设计研究所，亚利桑纳州坦佩市，邮编：85287；Ji.Qiu@asu.edu。

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用于研究翻译后修饰（PTM）自身抗基因组的反捕获蛋白质阵列平台

Kailash Karthikeyan公司等。分子细胞蛋白质组学. 2016年7月.

.2016年7月；15(7):2324-37.

doi:10.1074/mcp。M115.057661。 Epub 2016年5月2日。

附属公司

¹来自亚利桑那州立大学个性化诊断中心生物设计研究所，亚利桑纳州坦佩市，邮编：85287；
²§Engineering Arts LLC，亚利桑那州凤凰城，邮编85076；
^三来自亚利桑那州立大学个性化诊断中心生物设计研究所，亚利桑纳州坦佩市，邮编：85287；§工程艺术有限责任公司，亚利桑那州凤凰城85076；
⁴¶华盛顿州西雅图贝纳罗亚研究所，邮编：98101。
⁵来自亚利桑那州坦佩市亚利桑那州立大学个性化诊断中心生物设计研究所，邮编85287；Ji.Qiu@asu.edu。

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摘要

蛋白质的异常修饰发生在疾病发展过程中，并引发疾病特异性抗体反应。我们已经开发了一个蛋白质阵列平台，可以并行地修饰许多蛋白质，并评估其免疫原性，而无需单独表达、纯化和修饰蛋白质。我们在类风湿性关节炎（RA）中使用抗瓜氨酸蛋白抗体（ACPA）作为模型修饰，并在20名RA患者中分析了对~190种瓜氨酸蛋白的抗体反应。我们在临床抗环瓜氨酸肽检测阳性（CCP+）和CCP-RA患者中观察到独特的抗体反应模式。在单个抗原水平上，我们检测了已知瓜氨酸自身抗原的抗体，发现并验证了五种针对特定瓜氨酸抗原的新抗体（骨桥蛋白（SPP1）、皮瓣核酸内切酶（FEN1）、胰岛素样生长因子结合蛋白6（IGFBP6）、胰岛素类生长因子I（IGF1）和斯坦尼钙素-2（STC2）)RA患者。我们还证明了我们的创新阵列平台在瓜氨酸化抗原免疫显性表位鉴定中的实用性。我们相信，我们的平台将通过识别新的自身抗原并研究其在疾病发展中的作用，在前所未有的广度上促进翻译后修饰抗原的研究。所开发的平台可能用于研究许多与自身免疫疾病相关的修饰及其免疫原性。

PubMed免责声明

数字

**图2。**
**反捕获蛋白质阵列上11种已知瓜氨酸化自身抗原和EBNA血清反应性定量分析的热图。**本研究使用了30份血清样本（12份CCP+RA患者，8份CCP-RA患者，10份健康对照）。热图的左半部分显示了对天然蛋白质阵列的血清反应性，右半部分显示了对瓜氨酸化蛋白质阵列的血清反应性。EBNA被用作阳性血清保护性对照，因为大多数成年人对该抗原表现出血清阳性。蓝色，反应性低；红色，高反应性。

**图3。**
**用血清样本探测天然和瓜氨酸阵列的代表性图像。**所有样品均显示出对瓜氨酸化和天然EBNA的反应性。

**图4。**
**MBP血清反应性的定量比较。**从反捕获平台获得的结果与30份血清样本的抗瓜氨酸MBP ELISA平台。有关分析详细信息，请参阅方法。

**图5。**
**RA患者ACPA反捕获蛋白阵列对～190个抗原的血清分析，并通过ELISA验证反捕获阵列上识别的新ACPA。** A类，热图描绘了20份CCP+和CCP-血清样本对阵列上打印的190个基因的总体反应性。CCP阴性样品作为两个样品池进行分析，如图顶部所示。蓝色，低反应性；红色，高反应性。B，使用CCP+RA患者血清样本（S366和S451）探测的阵列图像示例。C类，通过ELISA对选定的新型ACPA进行盲验证，使用一组独立的150份血清，包括50份CCP+、50份CCP-和50份对照样品。HC，健康对照。*表示t吨测试第页< 0.05, **,第页<0.01和****，第页< 0.0001.D类，热图描述了在独立样本集的不同组中通过ELISA检测的瓜氨酸抗原的血清反应性。

**图6。**
**MBP的表位映射。**为MBP的每个亚型构建了八个C末端缺失片段。观察到两种反应模式。在模式1中，观察到对缺失突变体MBP 1.7、MBP 1.8、MBP 2.2和MBP 2.3的反应。在模式2中，观察到对缺失突变体MBP 1.8和MBP 2.3的反应，但对MBP 1.7和MBP 2.2没有反应。MBP 1.7和MBP 2.2共享相同序列，MBP 1.8和MBP 2.3共享相同序列。

**图7。**
**在反捕获阵列上检测针对Tn-糖基化蛋白的抗体。** A类，通过GalNac-T2、T3和T11进行Tn糖基化。蛋白质表达后，阵列未经处理（天然）或用三种GalNac-Ts中的一种处理，分别标记为GalNac-T2、GalNac-T3或GalNac-T11。方框中的特征代表阳性和阴性对照蛋白。GalNac-T2、-T3和-T11上的绿色方框表示MUC1-TR。GalNac-T3上的两个黄色方框分别表示APOE（右）和CD55（左）。APOE突变体（不可修改）显示在紫色方框中。B显示87种不同蛋白质经GalNac-T3糖基化的阵列的VVA和抗HaloTag染色。C类，使用GALNT3对（B）中显示的87种蛋白质进行抗体分析，包括（左栏）和（右栏）Tn-糖基化。S1571-IgA和S1571-IgG是同时检测样本S1571中IgA类和IgG类AAb的同一阵列。与S1660-IgG和S1660-IgA相同。

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