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.2016年8月；28(8):1124-36.
doi:10.1016/j.cellsig.2016.04.011。 Epub 2016年4月30日。

肌醇六磷酸激酶1（IP6K1）的缺失可减少细胞迁移和侵袭，从而保护小鼠免受空气消化道癌的侵袭

Rathan S Jadav公司 1, 达米卡·库马尔 2, 娜塔莎·布瓦 三, Shubhra神经节 1, Sitalakshmi R Thampatty公司 1, Nagaraj Balasubramanian语 三, 拉什纳·班达里 4
附属公司

肌醇六磷酸激酶1（IP6K1）的缺失可减少细胞迁移和侵袭，从而保护小鼠免受空气消化道癌的侵袭

Rathan S Jadav公司等。 单元格信号. 2016年8月.

摘要

肌醇六磷酸激酶（IP6Ks）是在所有真核生物中发现的一个酶家族，负责从六磷酸肌醇（IP6）合成5-二磷酸肌醇五磷酸（5-IP7）。在哺乳动物中发现了三种IP6K亚型，每种亚型的基因缺失都会导致小鼠出现不同的、不重叠的表型。先前的研究表明IP6K2在细胞迁移和侵袭中起促进作用，这些特性对肿瘤发生的早期阶段至关重要。然而，IP6K2在癌细胞凋亡中也有重要作用，缺乏该蛋白的小鼠在使用口腔致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）治疗后更容易发生消化道癌。同样丰富且普遍表达的IP6K1亚型在细胞迁移、侵袭和癌症进展中的功能尚不清楚。我们对缺乏IP6K1的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行了基因表达分析，揭示了该蛋白在调节肌动蛋白细胞骨架动力学的细胞受体-细胞外基质相互作用中的作用。因此，缺乏IP6K1的细胞表现出粘附依赖性信号的缺陷，明显表现为FAK和Paxillin激活降低，导致细胞扩散和迁移减少。活性而非非活性IP6K1的表达逆转了IP6K1-敲除MEF中的迁移缺陷，表明IP6K15-IP7的合成促进了细胞运动。肌动蛋白细胞骨架重塑和细胞迁移支持癌细胞实现其完全致癌潜能的能力。IP6K1水平较低的癌细胞迁移、侵袭和凤尾鱼非依赖性生长减少。当喂食口腔致癌物时，缺乏IP6K1的小鼠表现出从上皮异型增生到浸润性癌的进展减少。因此，我们的数据显示，与IP6K2一样，IP6K1也参与了癌症进展过程中的早期细胞骨架重塑事件。然而，与IP6K2不同，IP6K1对4NQO诱导的浸润性癌至关重要。因此，我们的研究揭示了IP6K1和IP6K2在癌症进展中作用的相似性和差异性，并且我们提出一种异构体特异性IP6K1抑制剂可能提供一种抑制致癌的新途径。

关键词：气消化道癌；细胞侵袭；细胞迁移；基因表达；肌醇六磷酸激酶；肌醇焦磷酸。

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图形摘要
图1
图1
删除Ip6k1型在小鼠中改变基因表达。RT-qPCR分析23个上调（A）和25个下调（B）基因，以验证在Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−MEF公司。值表示转录水平的折叠变化Ip6k1型−/−MEF标准化为Ip6k1型+/+MEF公司。微阵列数据是两个独立的Ip6k1型−/−MEF系与该基因在两个独立的Ip6k1型+/+MEF线路。RT-qPCR数据（来自两个独立实验的平均值±范围）是衍生的单个细胞中基因表达的倍数变化Ip6k1型−/−MEF线与导出的单电池相比Ip6k1型+/+MEF线路。这些细胞系用于进一步研究。图中的虚线表示从-1到+1的范围，即基因表达没有变化的区域。（C） 下调基因列表Ip6k1型−/−使用DAVID工具对MEF进行基因本体（GO）术语的功能注释聚类。该图描述了细胞成分（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）GO项的簇，组富集分数≥2（P≤0.01）。
图2
图2
IP6K1调节纤维连接蛋白上的细胞扩散。（A） 传播Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−在含有10%血清的情况下，在纤维连接蛋白上电镀15分钟后，通过Alexa Fluor 488-结合的卵磷脂染色观察MEFs。比例尺代表50μm（左侧面板）和10μm（右侧面板）。（B） 量化（A）；条形图显示了所示基因型MEF中15分钟后的细胞扩散面积。数据表示平均值±SEM（n=438和474个单元格Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−MEF），由四个独立实验汇编而成，并使用非参数双尾Mann-Whitney检验进行分析。（C） 在0.2%血清存在的情况下，纤维连接处电镀15分钟后MEF扩散，如（A）所示。比例尺代表50μm。（D） （C）的量化；条形图显示了所示基因型MEF中15分钟后的细胞扩散面积。数据表示平均值±SEM（n=216和230个单元格Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−MEF），由三个独立实验汇编而成，并按（B）进行分析。（E） 清洗未粘附细胞后，通过粘附细胞的结晶紫染色监测MEF与纤维粘连蛋白涂层表面的粘附。条形图显示了指定时间点的结晶紫吸光度值。数据是来自三个独立实验的平均值±SEM，由双尾非配对学生的t吨-测试。（F） 如方法部分所述，对MEF中的FAK和Paxillin活化进行免疫印迹分析。用指示的抗体探测膜，并使用肌动蛋白作为负荷控制。（G，H）面板F中pFAK（G）和pPaxillin（H）水平的量化。数据为两个独立实验的平均值±范围。（一） 用罗丹明结合的卵磷脂染色，显示在纤维连接蛋白上铺展24小时后细胞形态的代表性图像。比例尺代表50μm（左侧面板）和20μm（右侧面板显示同一字段的放大图像）。（J） 量化（I）；条形图显示了电镀后24小时的细胞扩散面积。数据表示平均值±SEM（n=20和22个单元格Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−MEF）由两个独立实验汇编而成，并使用非参数双尾Mann-Whitney检验进行分析***P≤0.001*P≤0.05；ns，不显著，P>0.05。
图3
图3
肌醇焦磷酸盐调节MEFs中的细胞迁移。（A） 将所示基因型的MEF接种在transwell插入物中，并在上部培养箱中用去血清培养基培养18小时，在下部培养箱中使用完全培养基培养。用DAPI染色观察向富含血清培养基迁移的细胞。比例尺代表50μm。（B） 通过对指定基因型的MEF进行划痕伤口愈合试验来监测细胞的聚集迁移。显示了指示时间点的代表性图像。图像上覆盖的黑线标志着伤口的边缘。（C） 量化（A）；条形图显示了18h后每个场迁移的细胞数。数据表示平均值±SEM（n=65和76字段Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−MEF；n=77和90字段Ip6k1型−/−表达IP6K1活性或非活性形式的MEF由两个独立的实验汇编而成，并使用单向方差分析和Tukey的多重比较试验进行分析。（D） 量化（B）中涵盖的面积；数据表示来自三个独立实验的平均值±SEM，并使用单向方差分析和Tukey的多重比较测试进行分析***P≤0.001*P≤0.05；ns，不显著，P>0.05。
图4
图4
表达抗人shRNA细胞的特性IP6K1防护等级（A）免疫印迹法检测稳定表达所示shRNA的HeLa和HCT116细胞株裂解物中的IP6K1（NT，非靶向对照；shIP6K1防护等级——1和shIP6K1防护等级——4，两种不同的针对人类的shRNA序列IP6K1防护等级). （B，C）条形图表示HeLa（B）和HCT116（C）中IP6K1的敲除水平。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。（D，E）HPLC图谱[三H] 肌醇标记的HeLa NT和shIP6K1–4级（D） 以及HCT116 NT和shIP6K1–1级（E） 细胞系。可溶性磷酸肌醇计数标准化为每个样品的总脂质肌醇计数。IP对应的峰值5，PP-IP4，IP6和IP7显示。数据是两个独立实验的代表。（F） 采用MTT法进行生长分析，以确定稳定表达所示shRNA的HeLa和HCT116细胞的倍增时间。数据表示三个独立实验的平均值±SEM，并使用单向方差分析和Tukey多重比较试验进行分析。在所有比较中，P值均大于0.05，表明表达sh的细胞加倍时间无显著差异IP6K1防护等级与NT相比。
图5
图5
IP6K1缺失可减少癌细胞迁移。（A） 在NT对照组和sh组中评估了Transwell迁移IP6K1防护等级表达HeLa（左侧）和HCT116细胞（右侧）。用DAPI染色观察接种后24小时向富含血清培养基迁移的细胞。比例尺代表50μm。（B，C）（A）的量化；条形图显示了HeLa（B）或HCT116（C）中每个场迁移的平均细胞数；数据表示平均值±SEM（n=127个字段，NT控制和sh分别为134个字段IP6K1–4级表达HeLa；n=152和186字段分别用于NT控制和shIP6K1–1级表达HCT116细胞）由三个独立的实验汇编而成，并使用非参数双尾Mann-Whitney检验进行分析。（D） 在融合单层上进行划痕伤口愈合试验，以监测所示细胞系中的集体细胞迁移。显示了指示时间点的代表性图像。图像上覆盖的黑线标志着伤口的边缘。（E，F）HeLa（E）或HCT116（F）细胞18小时后覆盖面积的量化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM，并使用双尾非配对学生的t吨-测试***P≤0.001*P≤0.05。
图6
图6
IP6K1缺失对癌细胞致瘤潜能的影响。（A） 3周后，用结晶紫染色观察并计数软琼脂中接种的细胞的非锚定生长情况。显示了结晶紫染色菌落的代表性图像。（B） 条形图显示了IP6K1缺失的HeLa和HCT116细胞中每个培养皿中归一化为各自NT对照的菌落数。数据是来自三个独立实验的平均值±SEM，并通过一个样本进行分析t吨-测试。（C） 在软琼脂（A）中形成的菌落以更高的放大率成像，如方法部分所述。（D，E）条形图，显示HeLa（D）和HCT116（E）细胞在软琼脂中生长3周后获得的菌落大小（对于HeLa NT对照组，n=66，对于HeLa-NT对照组，s=67）IP6K1–4级分别；n=63和52，用于HCT116 NT控制和shIP6K1–1级分别）。数据（平均值±SEM）代表了两个独立实验，并使用非参数双尾Mann-Whitney检验进行了分析。（F） HCT116 NT（顶行）和sh皮下异种移植IP6K1–1级（最下面一行）细胞，将细胞注射到同一只小鼠的两侧后4周分离。（G） 显示HCT116 NT和sh肿瘤重量的符号和线条图IP6K1–1级细胞。符号表示肿瘤重量分散，线条表示从同一只小鼠（n=8）两侧分离的肿瘤的成对分析。使用双尾配对Student’st吨-测试**P≤0.01*P≤0.05；ns，不显著，P≥0.05。
图7
图7
IP6K1调节癌细胞的侵袭潜能。（A） 稳定表达NT或sh的HCT116细胞IP6K1–1级被允许侵入基质凝胶基质以向高血清梯度移动24小时。典型的图像显示细胞通过凝胶迁移到膜的另一侧，通过DAPI染色进行可视化。比例尺代表50μm。（B） 量化（A）；条形图显示标准化为NT控件的入侵细胞数。数据是来自五个独立实验的平均值±SEM，并通过一个样本进行分析t吨-测试。（C） 表达NT或sh的HCT116细胞上皮标志物E-Cadherin的免疫印迹分析IP6K1–1级（D）（C）的量化；上皮标记物E-cadherin的水平表示为与作为负荷控制的GAPDH水平的比率。数据代表三个独立实验的平均值±SEM，并使用双尾非配对学生的t吨-测试**P≤0.01***P≤0.001。
图8
图8
IP6K1基因敲除使小鼠对4NQO诱导的致癌作用产生抵抗。Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−小鼠连续24周在饮用水中给予口腔致癌物4NQO。（A） H&E染色组织的代表性图像显示未经治疗的舌和食管的正常上皮Ip6k1型+/+小鼠（左面板），诱导舌和食管浸润癌Ip6k1型+/+小鼠（中间面板）和相同的组织Ip6k1型−/−显示发育不良和增生（右图）。比例尺代表100μm。（B） 堆积的条形图表示在所示基因型的小鼠中观察到的不同类型病变的百分比。n=11和9Ip6k1型+/+和Ip6k1型−/−小鼠。
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