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.2016年5月17日；113(20):5628-33.
doi:10.1073/pnas.1605547113。 Epub 2016年5月2日。

转录因子Mix1和VegT、VegT mRNA的重定域以及青蛙的保守内胚层和背侧规范

北海秀都 1, 安德烈斯·加塞斯·瓦斯科内斯 2, 玛丽亚·洛佩斯·拉托雷 2, Masanori Taira公司 三, 尤金妮亚·德尔皮诺 4
附属公司

转录因子Mix1和VegT、VegT mRNA的重定域以及青蛙的保守内胚层和背侧规范

北海秀都等。 美国国家科学院程序. .

摘要

转录因子基因mix1和vegt的蛋白表达表征了青蛙Engystomops randi、Epipedobates machalilla、Gastrotheca riobambae和Eleutheroactylus coqui胚胎中的推测内胚层，与非洲爪蟾胚胎中一样。所有青蛙的早期囊胚的动物半球都检测到VegT蛋白，只有动物极为VegT阴性。这一发现刺激了非洲爪蟾卵子和胚胎中的vegt mRNA分析。在非洲爪蟾卵和早期胚胎的动物区检测到vegt mRNA，与分析青蛙中观察到的vegt定位一致。此外，受精时卵子中出现了背向动物的蔬菜mRNA重定位。因此，比较分析表明，vegt除了在内胚层发育和胚层规范中发挥已知作用外，还可能参与背部发育。合子植物（zvegt）mRNA被检测为除非洲爪蟾卵的主要母体（mvegt）亚型外的一种次要亚型。此外，在囊胚的植物细胞核周围检测到α-amanitin不敏感的植物转录物。因此，植物细胞核周围的vegt mRNA积累是由重新定位引起的，而不是新的mRNA合成。植物细胞核周围的植物mRNA定位可能有助于植物胚泡球的鉴定。这些以及之前报道的vegt mRNA和蛋白质的定位特征来源于vegt在青蛙发育中的主要作用。比较分析表明，包括蔬菜和混合物1在内的内胚层和背部规格的策略在青蛙中是进化保守的。

关键词：囊胚；原肠胚；种质；mvegt；zvegt公司。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图S1。
图S1。
属的系统发生树及其比较X·莱维斯抗VegT多克隆抗体的表位序列蔬菜其他青蛙的序列。(A类)利用MEGA8对线粒体DNA进行最大似然分析得到的属的系统发生树。包括核糖体RNA基因（S16和12S）和tRNA-Val基因。万一G.里奥班贝，仅使用16S核糖体RNA基因，修改自参考文献。(B类)使用MEGA8线粒体DNA方法对VegT表位进行系统进化树。这个蔬菜序列E.兰迪未知。(C类)的序列对齐E.科基（Ec），马卡利埃希菌（Em），以及G.里奥班贝（Gr）对拉埃维斯X.laevis（Xl）。使用ClustalW多重序列比对对序列进行比对。将相同的残留物装箱*本研究分析了表位序列。
图1。
图1。
Mix1在青蛙胚胎中的免疫定位。动物半球朝向顶部。在所有物种的胚胎中，在植物半球均检测到深染的Mix1阳性细胞核。(A类,C类,E类,G公司、和H（H）)囊胚切片和二分囊胚H（H）. (B类,D类、和F类)原肠的矢状切面，背侧朝向右侧。(A类和B类)X·莱维斯胚胎。(C类和D类)E.兰迪胚胎。(E类和F类)马卡利埃希菌胚胎。(G公司)植物细胞G.里奥班贝9.75级囊胚。(H（H）)分裂囊胚E.科基第9.75阶段。囊胚腔顶部在固定过程中塌陷。裂胚和原肠胚G.里奥班贝和E.科基未进行分析。b、 囊胚腔；bf，囊胚腔底；dl，背胚孔唇。（比例尺：A类,B类,E类、和F类200微米；C类和D类150微米；G公司100µm；H（H）400微米）
图2。
图2。
VegT在青蛙胚胎中的免疫定位。动物半球朝向顶部。在所有物种的胚胎中，动物和植物半球均检测到深染的VegT阳性细胞核，只有动物极的最上方区域为VegT阴性。(A类和B类)的胚胎X·莱维斯. (A类)第5胚胎的副矢状切面。在动物和植物细胞中观察到VegT阳性细胞核。(B类)二分囊胚的VegT免疫定位和Hoechst 33258荧光。VegT阳性反应的深色使动物和植物细胞中的Hoechst 33258核荧光熄灭，而VegT阴性细胞核荧光明亮。(C类和D类)E.兰迪胚胎。(E类和F类)的胚胎马卡利埃希菌年胚胎固定过程中囊胚腔顶塌陷F类. (G–H′)一个胚胎G.里奥班贝. (G公司)st-8.5胚胎切片的全景图。该图由多个图像组成。边缘和植物区的区域被框起来，并以更高的放大倍数显示H（H）和H′显示VegT阳性细胞核。(H（H）)边缘地带。(H′)植被区。(我和J型)E.科基胚胎。(我)分裂囊胚。边缘区和植物区可见VegT阳性细胞核。(J型)高倍镜下st-8.5胚胎的植物区。可见VegT阳性细胞核。黑色箭头A类,B类,H（H）,H′,我、和J型指向VegT阳性细胞核。白色箭头B类指向一个VegT阴性核。b、 卵裂腔；bf，囊胚腔底；br，囊胚腔屋顶。（比例尺：A类,B类、和F类200微米；C类和D类150微米；E类，250µm；G公司和我300微米；H（H）,H′、和J型，100微米）
图S2。
图S2。
蔬菜mRNA和蛋白质的定位X·莱维斯囊胚。(A类和A′)VegT在半裂囊胚中的免疫定位。(B类和C类)原位杂交蔬菜囊胚半切面的mRNA表达。(A类)VegT免疫定位。方框区域以更高的放大倍数显示A′. (A′)胚胎的VegT免疫定位和DAPI核染色A类VegT的显色反应淬灭了VegT阳性核中的DAPI荧光。相比之下，VegT阴性细胞核具有明亮的荧光。(B类)图3方框区域的放大倍数更高H（H）.蔬菜转录物在颜色较浅的圆形结构周围检测到，可能是细胞核。(C类)后囊胚的DAPI核染色蔬菜mRNA原位杂交。核在蔬菜-阴性和阳性卵裂球。蔬菜在荧光明亮的细胞核周围检测到信使核糖核酸。白色箭头表示蔬菜-阴性细胞核。黑色箭头指向细胞核内的VegT蛋白积累。黑色箭头表示蔬菜细胞核周围的转录物。带有白色轮廓的黑色箭头指向蔬菜荧光DAPI染色细胞核周围的mRNA。
图S3。
图S3。
混合物1mRNA定位X·莱维斯胚胎。动物半球朝向顶部，背侧朝向右侧。在原位杂交之前，将胚胎背侧半切开。(A–C)布拉斯图莱。(D–F型)胃。白色箭头表示背部囊胚唇的位置。
图3。
图3。
蔬菜mRNA定位拉埃维斯X.laevis胚胎。动物半球朝向顶部。在所有胚胎中，背侧都是向右的。胚胎在原位杂交前被背半平分。该行图表总结了蔬菜未受精卵和st1的表达——9.5个胚胎。卵子的动物半球和囊胚腔顶（以灰色显示）是蔬菜-阴性，植物区（橙色）为蔬菜-积极的。(A类)未受精的卵。蔬菜mRNA在植物半球被发现，在动物区浓度较低。(B类)受精1小时后取卵。蔬菜mRNA在植物半球被检测到，并向动物背侧移位。此外，蔬菜在植物极的不规则区域检测到转录物，并与种质共定位。种质和线粒体定位如图S4所示E类——G公司. (C类)四细胞胚胎。(D类)八世纪的胚胎。(E–K公司)布拉斯图莱。(左旋-右旋)加斯图莱。(E–J公司)轻度染色的半囊胚蔬菜原位杂交。蔬菜mRNA主要定位于植物细胞核周围。中的装箱区域H（H）图S2中以较高的放大倍数显示B类. (E′–J′)原位杂交后的半囊胚染色较深。胚胎的深色部分掩盖了蔬菜细胞核周围的信使核糖核酸信号E′-G′与轻度染色的半囊胚相比E–G公司。黄色箭头表示的是蔬菜mRNA定位。植物区的白色箭头表示蔬菜种质中的转录本。黑色箭头指向蔬菜植物卵裂球中央区域的转录物。白色箭头表示背部囊胚唇的位置。
图4。
图4。
蔬菜mRNA亚型X·莱维斯未受精的卵和胚胎。(A类)蔬菜未受精卵的mRNA亚型通过RT-PCR扩增并在琼脂糖凝胶中分离。(B–D类)的相对表达式mvegt公司和zvegt公司通过RT-qPCR和ΔΔCt分析，以组蛋白H4表达为标准。(B类)未受精的卵。(C类)胚胎期7。(D类)早第9个胚胎。比率zvegt公司mRNA至mvegt公司mRNA含量为2.8%B类，4.0%英寸C类，年为5.2%D类.效率mvegt公司和兹韦格特引物集几乎相同。结果是三个独立实验的平均值。
图5。
图5。
Dorsoventral再定标蔬菜动物八细胞期胚胎（st4）卵裂球中mRNA的表达X·莱维斯. (A类)方法概述。(B类)定量mvegt公司和zvegt公司RT-qPCR在动物卵裂球中的表达，通过组蛋白H4的表达进行标准化。数据显示了三个独立实验的结果。背侧，背侧；P、 统计学P（P）价值；通风口，腹部。
图6。
图6。
α-amanitin对蔬菜,混合物1、和Xnr5号机组mRNA输入X·莱维斯胚胎。在双细胞期向每个卵裂球注射微量水或α-阿曼肽（每细胞100 pg），然后在指定的阶段对半分裂胚胎进行原位杂交或RT-qPCR。(A类,E类、和H（H）)用微量水处理胚胎的原位杂交。(B类,F类、和我)用α-鹅膏素处理的胚胎的原位杂交。(C类,D类、和G公司)的相对基因表达mvegt公司,兹韦格特、和Xnr5号机组通过组蛋白H4表达归一化的RT-qPCR检测。(A–D)蔬菜st-7胚胎的mRNA表达。(A类和B类)蔬菜mRNA原位杂交。(C类)mvegt公司相对基因表达。(D类)zvegt公司相对基因表达。(E–G公司)Xnr5号机组st-9胚胎的mRNA表达。(E类和F类)Xnr5号机组mRNA原位杂交。(G公司)Xnr5号机组相对基因表达。(H（H）和我)混合物1原位杂交检测st-9胚胎mRNA表达。数据显示了三个独立实验的结果。黑色箭头在A类和B类指向蔬菜植物卵裂球细胞核周围的转录物。a-Am，α-阿曼替丁；mQ，微Q水；ns，不显著；P、 统计学P（P）值。
图S4。
图S4。
线粒体和种质鉴定X·莱维斯囊胚。免疫检测方法见SI材料和方法线粒体标记物ab14730（Abcam）用于线粒体免疫检测。仅用二级抗体孵育胚胎，结果为阴性（未显示）。(A类)半等分胚胎中未经热处理的线粒体免疫检测。在卵裂球内检测到线粒体，可能在细胞核周围。(B类)囊胚切片的DAPI核染色。(C类)线粒体的免疫荧光检测同一部分，如B类. (D类)已合并B类和C类图像显示线粒体位于细胞核周围。(E类)在pH 9.0的TE缓冲液中65°C温度下过夜热处理后，半裂胚胎中线粒体的免疫定位，如SI材料和方法在细胞核周围和被认为是种质的植物岛上检测到线粒体。未接受热处理的胚胎中未检测到与种质相关的线粒体。(F类)通过定位检测半裂胚胎的种质蔬菜mRNA原位杂交。(G公司)用抗VegT免疫定位法对VegT蛋白进行定位，以检测半裂胚胎的种质。黑色箭头指向细胞核周围的线粒体。白色箭头表示种质。蓝色箭头指向DAPI染色的细胞核。红色箭头表示细胞核周围的线粒体。黑色箭头表示细胞核被线粒体包围的融合图像。a-mit，未经热处理的抗线粒体治疗；a-热处理后的抗线粒体治疗；a-VegT，抗VegT治疗。
图S5。
图S5。
植物视图X·莱维斯之后的胚胎蔬菜mRNA原位杂交。箭头指向蔬菜mRNA在植物极的种质岛中的定位。(A类)双细胞期胚胎。(B类)四细胞期胚胎。(C类)八细胞期胚胎。
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