Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold

doi:10.1089/ten.TEC.2015.0557

.2016年7月；22(7):621-35.

doi:10.1089/ten。TEC2015.0557。 Epub 2016年6月3日。

包括肿瘤基质的模拟转移：基于生物脱细胞肠支架构建三维结直肠癌模型的新技术

附属公司

¹1组织工程与再生医学研究所（TERM），德国瓦茨堡朱利叶斯·马西米利安大学大学医院。
²2德国瓦茨堡翻译中心“肿瘤和肌肉骨骼疾病的再生治疗”，弗劳恩霍夫研究所界面工程和生物技术IGB，瓦茨堡。
^三3德国维尔茨堡朱利叶斯·马克西米利安大学医院外科一，分子肿瘤学和免疫学。

PMID： 27137941
预防性维修识别码：项目经理4943469
内政部： 10.1089/10。2015年5月57日

包括肿瘤基质的模拟转移：基于生物脱细胞肠支架构建三维结直肠癌模型的新技术

莎拉·尼策等。组织工程C部分方法. 2016年7月.

.2016年7月；22(7):621-35.

doi:10.1089/ten。TEC2015.0557。 Epub 2016年6月3日。

附属公司

¹1组织工程与再生医学研究所（TERM），德国瓦茨堡朱利叶斯·马西米利安大学大学医院。
²2维尔茨堡转化中心“肿瘤和肌肉骨骼疾病的再生疗法”，德国维尔茨堡Fraunhofer接口工程和生物技术研究所IGB。
^三3德国瓦茨堡朱利叶斯-马西米利安大学大学医院分子肿瘤学和免疫学外科I部。

PMID： 27137941
预防性维修识别码：项目经理4943469
内政部： 10.1089/10。2005年5月20日

摘要

与自然微环境相比，基于塑料上二维培养的癌细胞系的肿瘤模型缺乏组织学复杂性和功能性。异种小鼠肿瘤模型显示出更高的复杂性，但由于物种特异性差异，往往无法准确预测人类药物反应。我们在这里提出了一个基于脱细胞猪空肠（小肠粘膜下层+粘膜，SISmuc）生物支架的三维（3D）体外结肠癌模型。两种不同的细胞系用于单细胞培养或与原代成纤维细胞共培养。经过14天的培养，我们发现人类Caco2结肠癌细胞与保存的基底膜在超微结构水平以及分化良好上皮的形态特征上紧密接触。为了建立组织工程肿瘤模型，我们选择了人类SW480结肠癌细胞，一种据报道为恶性的细胞系。2D细胞培养证实了恶性特征：SW480细胞比Caco2细胞表现出更高的波形蛋白和更低的E-cadherin表达。与Caco2相比，SW480细胞表现出癌性特征，如E-cadherin去定位和β-catenin在细胞亚群中的核定位。2D培养的一个主要缺点，特别是在药物测试方面，是其人工高增殖。在我们的3D组织工程肿瘤模型中，两种细胞系均显示增殖细胞数量减少，因此与所有阶段的原发性结肠癌观察结果（UICC I-IV）更精确地相关。此外，SW480结肠癌细胞中的波形蛋白减少，表明存在间充质向上皮的过渡过程，这归因于转移形成。只有与成纤维细胞共培养的SW480细胞诱导了由成纤维细胞包围的肿瘤样聚集物的形成，而在Caco2共培养中，Caco2细胞层与下面的成纤维细胞隔室分离形成。为了促进组织生成，构建了用于动态培养方法的生物反应器。这诱导了培养的肿瘤细胞与反映肿瘤活检的成纤维细胞之间的密切组织样联系。5-氟尿嘧啶（5-FU）治疗仅在3D共培养中有效。总之，我们的3D肿瘤模型反映了人类组织相关肿瘤的特征，包括较低的肿瘤细胞增殖。它现在可用于转移背景下的药物测试，特别是针对肿瘤-基质相互作用的物质。

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数字

<b>图1</b> — **图1。**
静态系统中的3D细胞培养。来自猪空肠的SISmuc支架固定在两个金属环之间，即细胞冠。细胞接种到支架上，并在12孔板中培养。为了将肿瘤细胞系与原代成纤维细胞共培养，从人类皮肤活检的真皮中分离出成纤维细胞，并与肿瘤细胞一起接种到支架上。3D、三维；SISmuc，保留粘膜的小肠粘膜下层。在线提供彩色图像网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图2</b> — **图2。**
用于在两个流体循环系统之间的界面培养组织的隔室生物反应器。**（A）**生物反应器包括组织室、蠕动泵和细胞培养基的贮存容器。蠕动泵从储液容器将细胞培养基输送至组织腔，在分离的腔室中容纳多达三个组织构建物。**（B）**这种隔间的剖面图描述了允许规定剪切应力条件的流动路径。在组织的两侧，独立的流体循环确保了顶端和基底侧的特定培养条件。不锈钢电极支持培养组织的电学特性。**（C）**入口体积流量为3.8时组织表面的流线和由此产生的剪切应力使用计算模型预测mL/min。除了～50的环 μm，剪切应力值在3.0和5.0之间 × 10⁻³N/m（牛顿/米）²进行了计算。**（D）**通过改变入口体积流量，生物反应器的工作范围可以预测入口体积流量特定速度下的平均剪切应力。根据工作范围，体积流量为3.8时的平均剪切应力 mL计算为3.34 × 10⁻³N/m（牛顿/米）²。在线提供彩色图像，网址为网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图3</b> — **图3。**
在传统的2D细胞培养中，SW480细胞表现出比Caco2细胞分化程度低、恶性程度高的表型。在二维细胞培养中，相比较图片显示SW480细胞向上聚集并与培养瓶底部失去接触**（A1）**而Caco2细胞显示出分化良好的单层**（A2）**.波形蛋白的免疫荧光双重染色(*红色右上*在里面B类,E类)和PCK(*绿色右上*在里面**B、 E类**)表明SW480中间充质标志物波形蛋白的高表达**（B）**与Caco2细胞相比**（E）**，通过qRT-PCR进行确认和量化**（D）**粘附连接蛋白E-cadherin的免疫荧光双重染色(*绿色右下角*在里面**C、 F类**)和β-连环蛋白(*红色右上*在里面**C、 F类**)证明E-cadherin在SW480中的表达较低**（C）**与Caco2细胞相比**（F）**β-连环蛋白定位于几个SW480细胞的细胞核(C类,箭头). E-cadherin的表达也可以通过qRT-PCR进行确认和量化**（D）**。比例尺英寸**（B–F）**: 25 微米。二维、二维；PCK，泛细胞角蛋白；qRT-PCR，定量实时PCR。在线提供彩色图像网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图4</b> — **图4。**
在3D SISmuc支架上，培养14天后Caco2细胞分化。石蜡切片绒毛的免疫组织化学DAB染色显示细胞生长7天后的基底外侧/细胞质位置**（A）**生长14天后其向顶端的变化(B类,箭头). 在SISmuc上培养14天的Caco2的超微结构分析显示，在SISmug顶部有一个封闭的单层。细胞显示出分化良好的微绒毛形态(**C、天**：mv），形成紧密的顶端紧密连接(箭头d）以及粘蛋白-空泡（v inD类). 细胞核标有n。此外，细胞附着在保存的基底膜上(* = 透明层，° = 致密层）。箭头在里面**（E）**：胶原蛋白纤维。DAB、二氨基联苯胺。在线提供彩色图像网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图5：</b> — **图5：。**
3D中增殖细胞的数量*在体外*与常规2D细胞培养相比，肿瘤模型减少，与低度恶性（UICC I）和高度恶性（UICC-IV）肿瘤的相关性更好。Caco2细胞的Ki67免疫荧光染色**（A）**和SW480电池**（B）**在二维细胞培养中显示出高增殖，而在三维细胞培养中Caco2明显减少**（C）**和SW480电池**（D）**。在3D培养条件下培养的增殖细胞数量与在低水平肿瘤中发现的增殖细胞的数量更精确地相关**（E、G）**和高等级**（F、H）**恶性肿瘤。从肿瘤边缘拍摄照片**（E、F）**以及从肿瘤中心**（G、H）**。比例尺输入**（D）**代表75 μm用于**（A–D）**。比例尺输入**（F）**代表50 μm用于**（东-西）**。彩色图像可在线获取，网址为网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图6</b> — **图6。**
成纤维细胞诱导肿瘤细胞在SISmuc支架上聚集SW480。3D石蜡切片HE染色*在体外*肿瘤模型显示Caco2细胞以单层形式生长**（A）**而SW480细胞表现出较低的分化表型，细胞与细胞之间的接触较松散**（C）**在这两种细胞系中，前隐窝（c）和绒毛（v）结构仍然清晰可见。与此相反，成纤维细胞将基质重塑为无绒毛结构的平坦层**（B）**PCK/vimentin双重免疫荧光染色显示Caco2和SW480细胞的强PCK染色**（D、F）**以及成纤维细胞中波形蛋白的高表达**（E）**与2D培养条件相比，3D培养条件下SW480中的Vimentin表达缺失(F类，插图：2D染色：PCK/vimentin）。共培养物的HE染色表明Caco2细胞保持单层结构，即使在某些部位也可以观察到多层结构**（G）**在SW480共培养中，肿瘤细胞的形态改变为基质内的肿瘤组织样聚集物(**H（H）**,箭头). PCK/波形蛋白免疫荧光双重染色显示，在Caco2共培养中，成纤维细胞停留在底部，肿瘤细胞位于顶部**（一）**而在SW480共培养中，肿瘤细胞被生长在肿瘤结节顶部、下方和之间的成纤维细胞包围**（J）**HE、苏木精和曙红。在线提供彩色图像网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图7</b> — **图7。**
与成纤维细胞共培养时，SW480肿瘤细胞改变了SISmuc的隐窝结构。在静态SW480单细胞培养中，β-catenin(红色在里面**A–D**)定位于几个细胞的细胞质和细胞核(箭头在里面A类). E-钙粘蛋白(绿色在里面**A–D**)染色显示细胞聚集体内单个区域的强表达(星星在里面A类). 在SW480和成纤维细胞的静态共培养中，E-cadherin染色更明显，尤其是在SW480-聚集体中，并且部分与β-catenin共定位(箭头在里面B类). 在流动生物反应器中的动态培养条件下，在共培养中这种效果得到了增强**（D）**与单一栽培相比**（C）**在单细胞培养中，SW480肿瘤细胞填满SISmuc支架的前隐窝并保持肠道的规则结构，而与成纤维细胞共培养的细胞重塑了前隐窝结构**（D）**这种效应在HE染色中更为明显(**E、 F类**)以及PCK的双重染色(绿色在里面**G、 H、，**肿瘤细胞）和胶原蛋白IV(红色在里面**G、 H（H）**，基底膜）。比例尺英寸**（A–C）**代表75 微米。比例尺英寸(**E–H）**代表500 微米。在线提供彩色图像网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图8</b> — **图8。**
具有完整成纤维细胞的3D结肠癌模型复制了患者的结肠腺癌。PCK公司(绿色)和波形蛋白(红色)荧光双重染色显示在动态生物反应器培养中SW480肿瘤细胞（PCK阳性）与共培养成纤维细胞（波形蛋白阳性）密切相关。该表型反映了患者活检中结肠腺癌的形态**（C）**.比例尺：50 μm英寸**（A）**,C）和100 μm英寸**（B）**。在线提供彩色图像，网址为网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图9：</b> — **图9：。**
在与成纤维细胞共培养中，SISmuc支架被重塑，成纤维细胞生长在肿瘤细胞的顶端。仅肿瘤细胞（以PCK标记，绿色)不要重塑SISmuc的胶原蛋白结构**（A–C）**免疫组化IV型胶原染色可清楚地看到前隐窝的基底膜(红色在里面**A–I**)并且不会被中断(箭头在里面B类). 与成纤维细胞共培养**（D–F）**，原来地窖的清晰边界仅部分可见(箭头在里面E类)SISmuc被胶原蛋白IV压实**（E、F）**在单细胞培养中，成纤维细胞重塑SISmuc（G、H）在共培养的某些区域，成纤维细胞（被波形蛋白染色，红色在里面**J、 K（K）**)与肿瘤细胞混合（PCK染色，绿色在里面**J、 K（K）**)在它们前面生长成SISmuc的胶原蛋白结构**（K）**。比例尺英寸**（G–I）**代表25 μm用于**（A–I）**。比例尺英寸**（J）**和**（K）**代表25 微米。在线提供彩色图像网址：www.liebertpub.com/tec

<b>图10</b> — **图10。**
SW480与25 静态和动态条件下的μM 5-FU。在静态培养条件下**（A、B）**，5-FU治疗导致肿瘤细胞数量减少(绿色)但会留下成纤维细胞(红色)未受影响的**（B）**在动态条件下也可以看到相同的效果**（C、D）**未经治疗的对照组肿瘤细胞数量要高得多**（C）**与处理过的样品相比**（D）**D中的比例尺：100 μm用于**（A–D）**.PCK公司：绿色，波形蛋白：红色，DAPI：蓝色.5-FU，5-氟尿嘧啶。在线提供彩色图像网址：www.liebertpub.com/tec

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