Architecture of the mitochondrial calcium uniporter

doi:10.1038/nature17656

.2016年5月12日；533(7602):269-73.

doi:10.1038/nature17656。 Epub 2016年5月2日。

线粒体钙单转运蛋白的结构

附属公司

¹美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院生物化学和分子药理学系，邮编：02115。
²上海国家蛋白质科学中心分子生物学国家重点实验室，上海生物化学与细胞生物学研究所，中国科学院上海科学研究中心，上海200031，中国。
^三南开大学元素有机化学与化学学院国家重点实验室，天津300071。
⁴美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系和霍华德·休斯医学院，邮编02114。

PMID： 27135929
预防性维修识别码：项目经理4874835
内政部： 10.1038/自然17656

线粒体钙单转运蛋白的结构

Kirill Oxenoid公司等。性质. 2016.

.2016年5月12日；533(7602):269-73.

doi:10.1038/nature17656。 Epub 2016年5月2日。

作者

附属公司

¹美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院生物化学和分子药理学系，邮编：02115。
²上海国家蛋白质科学中心分子生物学国家重点实验室，上海生物化学与细胞生物学研究所，中国科学院上海科学研究中心，上海200031，中国。
^三南开大学元素有机化学与化学学院国家重点实验室，天津300071。
⁴美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院分子生物学系和霍华德·休斯医学院，邮编02114。

PMID： 27135929
预防性维修识别码：项目经理4874835
内政部： 10.1038/自然17656

摘要

许多真核生物分支的线粒体通过一种称为单转运蛋白的内膜转运蛋白吸收大量钙（Ca（2+））。单转运蛋白的转运依赖于膜电位，对钌红或其衍生物Ru360敏感（参考文献1）。电生理研究表明，单转运蛋白是一种具有极高电导和选择性的离子通道。众所周知，Ca（2+）进入线粒体也能激活三羧酸循环，似乎对线粒体ATP的生成与其细胞溶质需求相匹配至关重要。线粒体钙单转运蛋白（MCU）是单转运蛋白全息复合物的成孔和钙（2+）传导亚基，但其一级序列与迄今为止研究的任何钙通道都不相似。在这里，我们报告了利用核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）测定的秀丽隐杆线虫MCU孔结构域的结构。MCU是一种同源异构体，其中第二个跨膜螺旋在膜上形成亲水孔。通道组合代表了一种新的离子通道结构解决方案，并由一个突入线粒体基质的线圈基序来稳定。关键的DXXE基序形成孔入口，具有两个羧酸环；根据环的尺寸和功能突变，这些环似乎形成了选择性过滤器。据我们所知，这是核磁共振表征的最大膜蛋白结构之一，为理解该通道的功能提供了结构蓝图。

PubMed免责声明

数字

**扩展数据图1。全长hMCU、全长cMCU和cMCU-ΔNTD的多序列比对**
在所有三个序列中不变的残基用红色阴影表示。部分保守残基和不太保守的残基分别用蓝色和灰色阴影表示。在cMCU-ΔNTD中引入的突变用黄色阴影表示。DxxE基序中的D和E由显示与Ru360抑制有关的丝氨酸残基用*表示。在本研究中，螺旋段由核磁共振测定，用圆柱表示，并按正文所示进行标记。hMCU和cMCU的登录号分别为NM_138357.1和NP_500892.1。

公式图像 — **扩展数据图1。全长hMCU、全长cMCU和cMCU-ΔNTD的多序列比对**
在所有三个序列中不变的残基用红色阴影表示。部分保守残基和不太保守的残基分别用蓝色和灰色阴影表示。在cMCU-ΔNTD中引入的突变用黄色阴影表示。DxxE基序中的D和E由显示与Ru360抑制有关的丝氨酸残基用*表示。在本研究中，螺旋段由核磁共振测定，用圆柱表示，并按正文所示进行标记。hMCU和cMCU的登录号分别为NM_138357.1和NP_500892.1。

**扩展数据图2。cMCU-ΔNTD寡聚态的生化分析**
**a、，**20 mM MES（pH 6.4）、75 mM NaCl、0.48 mM Foscholine-14、0.3 mM NaN中Superdex 200 10/300 GL柱的cMCU-ΔNTD洗脱峰_三和2 mM EDTA。**b、，**洗脱峰的SDS-PAGE分析显示样品纯度>95%。**c、，**cMCU-ΔNTD稀释核磁共振样品的尺寸排除色谱-多角度光散射（SEC-MALS）分析。基于三探测器法，采用SEC-MALS/UV/RI测量法测定cMCU-ΔNTD分子质量。在这种方法中，由于FC-14洗涤剂在280 nm处没有紫外线吸收，因此直接计算蛋白质质量，而不校正结合胶束。色谱图显示了90°（红色）、RI（蓝色）和UV（绿色）检测器下LS的读数。左右轴分别表示LS检测器读数和分子质量。黑色曲线代表计算的分子质量，cMCU-ΔNTD洗脱峰的平均质量为92kDa。注：（a）和（c）之间洗脱体积的差异约为10 ml，这是由于从SEC到MALS的溶液供给体积所致。d日，稀释cMCU-ΔNTD NMR样品的化学交联SDS-PAGE分析。反应混合物包含0.1 mM cMCU-ΔNTD（单体）、3 mM Foscholine-14和各种数量的DTSSP。在1小时后，通过添加2μl 1M Tris（pH 7.5）来终止反应。将淬火后的样品装入12%Bis-Tris凝胶中（Novex Life Technologies）。使用标准方案对凝胶进行银染。M.W.标记右侧的五条车道对应于0、5、7、10和15 mM的DTSSP浓度。对应于五聚体的带显示出强度随[DTSSP]的变化而最明显的增加。

**扩展数据图3。具有残基特异性分配的cMCU-ΔNTD甲基共振**
这个¹小时-¹³连续28 ms记录C HSQC¹³900 MHz时的C演变。

**扩展数据图4。cMCU-ΔNTD低聚物的单粒子EM**
**a、，**cMCU-ΔNTD低聚物用甲酸铀负染的典型图像。条形对应于50 nm的长度。选定的cMCU-ΔNTD粒子子集用白色圆圈高亮显示。左上角显示的是选定粒子的典型俯视图/仰视图和典型侧视图。**b、，**202个粒子中的100个粒子的无参考2D类平均值，揭示了复合体（五边形）中存在5倍对称性。**c、，**比较未强制C5对称（顶行）重建的三维EM密度图的不同视图与对称重建的相应视图（底行）。最大的差异出现在TM域和CC域之间的中间凸起区域，这可能是因为大型L2环中缺乏刚性结构。**日期：，**比较3D EM密度图的2D投影（顶部）与相应的无参考2D类。**e（电子）**，估算最终3D重建的分辨率。傅里叶壳层相关（FSC）表明，使用0.5标准，分辨率为～18º。

**扩展数据图5。混合同位素标记样品中的单体NOE**
示例取自3D¹⁵含1:1混合物的混合标签样品的N编辑NOESY-TROSY(¹⁵N、，²H） -标记cMCU-ΔNTD和（15%¹³C） -标记为cMCU-ΔNTD。**a、，**样品¹小时-¹各种H带¹⁵N化学位移显示C-末端CCH结构域的主链酰胺质子和脂肪族质子之间的单体NOE。在23°C、900 MHz下记录NOE光谱。**b、，**样品条显示TMH2孔内以及选择性过滤区域内的单体间NOE。在33°C、900 MHz下记录NOE光谱。在每个面板的右侧，结构上下文中的相互单体NOE显示为红线。

**扩展数据图6。基于NMR约束和EM模型拟合的cMCU-ΔNTD五聚体的结构系综**
**a、，**使用NMR导出的结构约束计算的15个最低能量结构的集合（见扩展数据表1）。为了清楚起见，未定义的环L1（残基166-179）和L2（残基272-292）未显示。**b、，**使用刚体拟合（Chimera中的“拟合”工具）将不含环路区域L1和L2的cMCU-ΔNTD的NMR结构拟合到EM体积。然而，L1和L2包含在显示中。膜间空间侧俯视图。**c、，**矩阵侧的底视图。**d-e、，**两个不同的侧视图。请注意，由于缺乏NMR衍生的结构约束，回路区域看起来无序。这并不一定意味着它们没有获得任何稳定的构象。在这种情况下，不考虑膜包埋区域周围的假定洗涤剂分子。

**扩展数据图7。CCH肽化学交联的SDS-PAGE分析**
含有0.1 mM肽（cMCU残基288–316加上cMCU-ΔNTD构建体中的C末端L和E）和各种量的DTSSP的反应混合物在反应1小时后通过加入1μL 1M Tris（pH 7.5）而猝灭。将淬火后的样品装入12%Bis-Tris凝胶中（Novex Life Technologies）。使用标准方案对凝胶进行银染。M.W.标记右侧的四条车道对应于DTSSP:CCH比率0、10:1、30:1和50:1。

**扩展数据图8。揭示cMCU-ΔNTD五聚体表面暴露和核心氨基酸性质的表面表征**
疏水、极性和带电残留物分别以黄色、青色和蓝色显示。疏水残基包括A、I、L、F、V、P和G，极性残基包括Q、N、H、S、T、Y、C、M和W，带电残基包括K、R、D和E。实线表示假定脂质双层的疏水核心边界。**a、，**去除非结构化环的五聚体。**b、，**与（a）中相同的视图，去掉前面的子单元以显示核心。

**扩展数据图9。删除HsMCU（HsMCU-ΔNTD）中的N末端结构域（aa 58-186）不会损害其功能**
添加50μM CaCl后，洋地黄素渗透细胞中钙吸收的典型痕迹₂如左图所示。条形图显示了与WT HEK 293T细胞相关的钙摄取率（平均值±标准差，n=4）。用抗FLAG抗体免疫印迹法分析细胞裂解产物，检测MCU蛋白的表达。采用ATP5A作为负荷控制。

**图1。cMCU-ΔNTD的NMR和EM表征**
**a、，**MCU的域组织（使用COILS和TMHMM程序预测）。**b、，** ¹小时-¹⁵N TROSY-HSQC光谱(¹⁵N、，²H） -标记的cMCU-ΔNTD低聚物，在Foscholine-14中重组，在900MHz和23°C下记录。插图中的峰对应于色氨酸侧链胺。**c、，**在核磁共振样品条件下，Ru360与cMCU-∆NTD（左）和S238A突变体（右）结合的等温滴定量热分析。顶部和底部图表分别显示了原始数据（μcal/second vs.time）和归一化积分数据（kcal/mole of injectant vs.mol ratio；mol ratio=Ru360:cMCU-∆NTD pentamer）。数据拟合结果*K（K）*_D类=24±8μM。**日期：，**使用与NMR样品相同的方法制备的蛋白质样品对cMCU-ΔNTD低聚物进行负染EM重建。在18℃下过滤的cMCU-ΔNTD低聚物的最终3D体积视图。

**图2。cMCU-ΔNTD五聚体的结构**
**a、，**cMCU-ΔNTD结构的带状表示显示三个不同的层，分别对应于跨膜（TM；橙色）、近膜（JM；青色）和膜外结构域（EMD；蓝色）区域。**b、，**cMCU-ΔNTD五聚体的卡通表示，显示了单转运体核心的形成，该核心由TMH2（黄色）形成的TM孔和CCH（海洋）形成的螺旋状五聚体组成。该结构被放置在假定的膜中，使得TM结构域中的外围疏水残基是面向脂质的。**c、，**cMCU-ΔNTD五聚体的两个亚单位的卡通表示，显示单个亚单位的折叠。螺旋线段在文本中定义。标记为L1和L2的虚线对应于蛋白质的非结构区域。

**图3。孔和离子选择性过滤器的结构**
**a、，**TM域的卡通表示，显示包含DxxE Ca的TM孔口处的迷你桶²⁺选择性元素。**b、，**包含DxxE区域的放大图，用于显示Asp240和Glu243的侧链构象多样性。**c、，**亚基1和3的TM结构域，用于显示孔衬残基。**日期：，**使用程序HOLE计算的孔隙表面。通道中绿色区域的宽度只允许一个水分子通过，而蓝色部分可以容纳两个或多个水分子。红色区域太窄，不允许任何水通过。

**图4。cMCU-ΔNTD结构诱导HsMCU功能突变**
**a、，**无半胱氨酸MCU（MCU^立方英尺)与野生型MCU（MCU^重量)在MCU敲除（KO）细胞中。**b、，**MCU Glu257突变为Ala或Ser不会损害其功能。**c、，**Asp261突变为Glu允许离子通过MCU渗透，而Glu264突变为Asp会损害功能。**日期：，**Ser259突变为Arg会损害MCU功能。**a-d、，**添加50μM CaCl后，洋地黄素渗透细胞中钙吸收的典型痕迹₂如左图所示。条形图显示了与WT HEK 293T细胞相关的钙摄取率（平均值±标准差，n=4）。用抗FLAG抗体免疫印迹法分析细胞裂解产物，检测MCU蛋白的表达。采用ATP5A作为负荷控制。

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1. Kirichok Y，Krapivinsky G，Clapham DE。线粒体钙单转运蛋白是一种高选择性离子通道。自然。2004;427:360–364.-公共医学
1. 丹顿RM，麦科马克JG。钙在线粒体代谢调节中的作用。生物化学Soc Trans。1980;8:266–268.-公共医学
1. Baughman JM等。综合基因组学确定MCU是线粒体钙单转运蛋白的重要组成部分。自然。2011;476:341–345.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Perocchi F等。MICU1编码摄取Ca（2+）所需的线粒体EF手蛋白。自然。2010;467:291–296.-项目管理咨询公司-公共医学

方法参考

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[1] Gunter TE，Pfeiffer DR。线粒体运输钙的机制。美国生理学杂志。1990;258:C755-786。-公共医学

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[4] Kirichok Y，Krapivinsky G，Clapham DE。线粒体钙单转运蛋白是一种高选择性离子通道。自然。2004;427:360–364.-公共医学

[5] 丹顿RM，麦科马克JG。钙在线粒体代谢调节中的作用。生物化学Soc Trans。1980;8:266–268.-公共医学

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[7] Baughman JM等。综合基因组学确定MCU是线粒体钙单转运蛋白的重要组成部分。自然。2011;476:341–345.-项目管理咨询公司-公共医学

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