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.2016年6月2日；12(6):976-98.
doi:10.1080/15548627.2016.1166317。 Epub 2016年4月28日。

单侧输尿管梗阻时肾小管细胞持续激活自噬促进肾间质纤维化

曼·利文斯顿 1, 韩非定 2, 双黄 三, 约瑟夫·希尔 4, 尹晓明 5, 郑东 1 6
附属公司

单侧输尿管梗阻时肾小管细胞持续激活自噬促进肾间质纤维化

曼·利文斯顿等。 自噬. .

摘要

肾纤维化是终末期肾病的最终常见途径。自噬是否以及如何导致肾纤维化尚不清楚。在小鼠单侧输尿管梗阻（UUO）的肾纤维化模型中，我们首次检测到肾近端小管中的持续自噬。自噬药物抑制剂和肾脏近端小管特异性自噬相关7基因敲除（PT-Atg7 KO）抑制了UUO相关纤维化。同样，PT-Atg7 KO小鼠ACTA2/α-平滑肌肌动蛋白和VIM（波形蛋白）的表达表明，成纤维细胞的增殖和活化受到抑制，包括FN1（纤维连接蛋白1）和胶原纤维在内的细胞外基质成分的积累也受到抑制。这些小鼠的肾小管萎缩、凋亡、肾单位丢失和间质巨噬细胞浸润均受到抑制。此外，这些小鼠表现出对纤维化前因子FGF2（成纤维细胞生长因子2）表达的特异性抑制。体外，TGFB1（转化生长因子β1）诱导原代近端肾小管细胞自噬、凋亡和FN1积聚。抑制自噬抑制FN1的积累和凋亡，而增强自噬增加TGFB1诱导的细胞死亡。这些结果表明，肾近端小管自噬的持续激活促进了UUO期间的肾间质纤维化。自噬的促纤维化功能与调控肾小管细胞死亡、间质炎症和促纤维化因子的产生有关。

关键词：自噬；肾损伤；近端小管；肾纤维化；单侧输尿管梗阻。

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数字

图1。
图1。
UUO期间肾近端小管持续诱导自噬。C57Bl/6（A、B、F、G和H）或CAG-RFP-GFP-LC3（C、D和E）小鼠接受假手术或UUO手术。在指定的时间点（2天、4天、1周和2周）处死小鼠，收集左肾进行组织学和免疫印迹分析。（A） LC3B免疫组化染色的代表性图像。偶有细胞核LC3B阳性染色；然而，在没有初级抗体的情况下，在假对照组或UUO肾组织中均未观察到LC3B阳性染色（数据未显示），这表明LC3B染色的特异性。比例尺：20µm。（B） 点状LC3B染色的定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著性差异。（C） GFP-LC3和RFP-LC3荧光染色的代表性图像。比例尺：15µm。（D） GFP-LC3和RFP-LC3点的定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，RFP-LC3点的值与GFP-LC3点的相关值显著不同。（E） 自噬流量率分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著性差异。（F） LC3B、SQSTM1、ACTA2和FN1免疫印迹分析的代表性图像。PPIB被用作加载控制。（G） LC3B、SQSTM1、ACTA2和FN1信号的密度分析。在用PPIB标准化后，将假手术的蛋白质信号任意设置为1，并用假手术对照标准化其他条件的信号以计算倍数变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著性差异。（H） Masson三色染色的代表性图像。比例尺：50µm。
图2。
图2。
药物抑制自噬可减少UUO期间的间质纤维化。C57Bl/6小鼠分为4组：1。假手术；2.UUO+生理盐水；3、UUO+60 mg/kg氯喹（CQ）；4.UUO+30 mg/kg 3-甲基腺嘌呤（3-MA）。在指定的时间点（1周和2周）处死小鼠，收集左肾进行组织学和免疫印迹分析。（A） LC3B、SQSTM1、ACTA2和FN1免疫印迹分析的代表性图像。ACTB被用作加载控制。（B） LC3B、SQSTM1、ACTA2和FN1信号的密度分析。用ACTB归一化后，假手术的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号用假手术归一化以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与UUO+生理盐水组有显著差异。（C） Masson三色染色的代表性图像。比例尺：50µm。（D） Masson三色染色定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与UUO+生理盐水组有显著差异。
图3。
图3。
自噬的药理学抑制减弱UUO过程中诱导的肾小管细胞凋亡。动物及其治疗方法如图2所示。（A） TUNEL染色的代表性图像。比例尺：50µm。（B） TUNEL染色定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与UUO+生理盐水组有显著差异。
图4。
图4。
PT患者近端小管自噬受损-附件7UUO期间击倒小鼠。悬浮控制（PT-附件7FC）和PT-附件7KO小鼠（同窝或年龄匹配）接受假手术或UUO手术。在指定的时间点（4天、1周和2周）处死小鼠，收集左肾进行组织学和免疫印迹分析。（A） LC3B免疫组化染色的代表性图像。比例尺：20µm。（B） LC3B染色放大图像。比例尺：20µm。(C类)LC3B、SQSTM1和ATG7免疫印迹分析的代表性图像。PPIB被用作加载控制。
图5。
图5。
PT自噬缺陷-附件7敲除小鼠在UUO期间抑制肾间质纤维化、肾小管萎缩和肾单位丢失。动物及其治疗方法如图4所示。（A） ACTA2、VIM、FN1和FGF2免疫印迹分析的代表性图像。PPIB被用作加载控制。（B） ACTA2、VIM、FN1和FGF2信号的密度分析。用PPIB标准化后，PT的蛋白质信号-附件7FC假手术被任意设置为1，其他条件下的信号用PT标准化-附件7FC sham计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与PT显著不同-第7页FC假手术组；#，P（P）<0.05，与相关PT显著不同-附件7FC组。（C） Masson三色染色的代表性图像。比例尺：50µm。（D） Masson三色染色的定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与PT显著不同-附件7FC假手术组；#，P（P）<0.05，与相关PT显著不同-附件7FC组。（E） PAS染色的代表性图像。比例尺：50µm。（F） LTL染色的代表性图像。比例尺：50µm。（G） LTL染色定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与PT显著不同-附件7FC假手术组；#，P（P）<0.05，与相关PT显著不同-附件7FC组。
图6。
图6。
肾小管细胞凋亡和间质炎症也在PT中减弱-附件7UUO期间击倒小鼠。动物及其治疗方法如图4所示。（A） TUNEL染色的代表性图像。比例尺：50µm。（B） TUNEL染色定量分析。数据表示为平均值±标准差*，P（P）<0.05，与相关PT显著不同-附件7FC组。（C） 巨噬细胞染色的代表性图像。比例尺：50µm。（D） 巨噬细胞染色定量分析。数据表示为平均值±标准差*，P（P）<0.05，与PT显著不同-附件7FC假手术组；#，P（P）<0.05，与相关PT显著不同-附件7FC组。
图7。
图7。
在UUO期间，近端小管MTOR激活被PT自噬缺陷抑制-附件7击倒老鼠。动物及其治疗方法如图4所示。（A） 磷酸化-RPS6KB1和RPS6KB1免疫印迹分析的代表性图像。PPIB被用作加载控制。（B） 磷酸化-RPS6KB1信号的密度分析。经RPS6KB1和PPIB归一化后，PT的蛋白信号-附件7FC假手术被任意设置为1，其他条件下的信号用PT标准化-附件7FC sham计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与PT显著不同-附件7FC假手术组；#，P（P）<0.05，与相关PT显著不同-附件7FC组。
图8。
图8。
TGFB1在BUMPT小鼠近端肾小管细胞系中诱导自噬并伴有纤维化前病变。BUMPT细胞未经处理（d0）或用5ng/ml TGFB1处理1-3天。在一些实验中，用mRFP-GFP-LC3瞬时转染BUMPT细胞，然后在不存在或存在20μM氯喹（CQ）的情况下未经处理（对照）或用5ng/ml TGFB1处理。处理后收集细胞进行形态学和免疫印迹分析。（A） 显示细胞形态的典型相位对比图像。比例尺：50µm。（B） 荧光显微镜的代表性图像显示细胞中的GFP-LC3和mRFP-LC3点状物。比例尺：15µm。（C） GFP-LC3和mRFP-LC3点的定量分析。数据表示为平均值±标准差*，P（P）<0.05，与相关对照组差异显著；ˆ,P（P）<0.05，与TGFB1组显著不同。#，P（P）<0.05，与GFP-LC3点状计数有显著差异。（D） 自噬流量率分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著；#，P（P）<0.05，与TGFB1组有显著差异。（E） LC3B、SQSTM1、FN1、VIM和CDH1免疫印迹分析的代表性图像。ACTB被用作加载控制。（F） LC3B、SQSTM1、FN1、VIM和CDH1信号的密度分析。用ACTB归一化后，对照组（第0天）的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号用对照组归一化以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著。
图9。
图9。
抑制自噬抑制TGFB1处理的近端肾小管细胞中FN1的积累，而不影响表型转换。（A） 在没有（−）或存在（+）20μM氯喹（CQ）的情况下，不处理BUMPT细胞（第0天）或用5 ng/ml TGFB1处理1至3天。处理后收集细胞进行LC3B、SQSTM1、FN1、VIM和CDH1的免疫印迹分析。ACTB被用作加载控制。（B） FN1信号的密度分析。用ACTB标准化后，对照组（第0天，CQ-）的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号用对照组标准化以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组（第0天，CQ-）有显著差异；#，P（P）<0.05，与TGFB1（CQ-）组差异显著。（C）附件7漂浮对照组（FC）和KO近端肾小管细胞未经处理（第0天）或用5 ng/ml TGFB1处理1至3天。处理后收集细胞进行LC3B、SQSTM1、FN1、VIM和CDH1的免疫印迹分析。ACTB被用作加载控制。（D） FN1信号的密度分析。在用ACTB标准化后附件7FC控制（d 0）被任意设置为1，其他条件的信号用附件7FC控制计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与第7页FC控制组；#，P（P）<0.05，与相关附件7FC组。
图10。
图10。
TGFB1诱导的近端肾小管细胞原代培养凋亡受到自噬抑制的抑制。在没有或存在20μM氯喹（CQ）或10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）的情况下，未对原代细胞进行处理（对照）或用5 ng/ml TGFB1处理24 h。处理后收集细胞进行形态学、生化和免疫印迹分析。（A，D）LC3B和SQSTM1免疫印迹分析的代表性图像。ACTB被用作加载控制。（B，E）相位对比和荧光显微镜的代表性图像，显示凋亡的细胞和核形态。比例尺：200µm。（C，F）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组有显著差异；#，P（P）<0.05，与TGFB1或附件7FC TGFB1组。
图11。
图11。
抑制自噬可减轻TGFB1处理的原代近端肾小管细胞的纤维化变化。原代细胞按照图10中所述的方法进行处理。（A、C、E）FN1和VIM免疫印迹分析的代表性图像。ACTB被用作加载控制。（B，D，F）FN1和VIM信号的密度分析。用ACTB标准化后，控制或附件7FC控制被任意设置为1，其他条件的信号用控制进行标准化，以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准差*，P（P）<0.05，与对照组或附件7FC控制组；#，P（P）<0.05，与TGFB1或附件7FC TGFB1组。
图12。
图12。
Z-VAD抑制凋亡并不影响TGFB1处理的原代近端肾小管细胞的自噬诱导和纤维化改变。在没有或存在100μM Z-VAD的情况下，未对原代细胞进行处理（对照）或用5 ng/ml TGFB1处理24 h。处理后收集细胞进行形态学和免疫印迹分析。（A） 相位对比和荧光显微镜的代表性图像显示细胞和细胞核凋亡的形态。比例尺：200µm。（B） LC3B、SQSTM1、FN1和VIM免疫印迹分析的代表性图像。ACTB被用作加载控制。（C） LC3B、SQSTM1、FN1和VIM信号的密度分析。用ACTB归一化后，对照组的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号用对照组归一化以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著。
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