Robust Lys63-Linked Ubiquitination of RIG-I Promotes Cytokine Eruption in Early Influenza B Virus Infection

doi:10.1128/JVI.00549-16

.2016年6月24日；90(14):6263-6275.

doi:10.1128/JVI.00549-16。 2016年7月15日印刷。

RIG-I的稳健Lys63连锁泛素化促进B型流感病毒早期感染的细胞因子爆发

姜静文^1 2, 李静（音译）^三, 范文慧², 渭南郑², 孟玉², 陈灿（Can Chen）², 孙雷（Lei Sun）², 于海碧², 陈丁⁴, 高福^1 2 5, 刘文军^6 2 5

附属公司

¹中国科技大学生命科学学院，合肥，中国。
²中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，北京。
^三中国科学院微生物研究所中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室liuwj@im.ac.cn lj418@163.com。
⁴中国农业科学院上海兽医研究所，中国上海。
⁵中国科学院大学，北京，中国。
⁶中国科技大学生命科学学院，合肥，中国liuwj@im.ac.cn lj418@163.com。

PMID： 27122586
预防性维修识别码：项目经理4936144
内政部： 10.1128/JVI.00549-16

RIG-I的稳健Lys63-连锁泛素化促进B型流感病毒早期感染的细胞因子爆发

蒋静文等。 J维罗尔. 2016.

.2016年6月24日；90(14):6263-6275.

doi:10.1128/JVI.00549-16。 2016年7月15日印刷。

作者

姜静文^1 2, 李静（音译）^三, 范文慧², 渭南郑², 孟玉², 陈灿（Can Chen）², 孙雷（Lei Sun）², 于海碧², 陈丁⁴, 高福^1 2 5, 刘文军^6 2 5

附属公司

¹中国科技大学生命科学学院，合肥，中国。
²中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，北京。
^三中国科学院微生物研究所中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室liuwj@im.ac.cn lj418@163.com。
⁴中国农业科学院上海兽医研究所，中国上海。
⁵中国科学院大学，北京，中国。
⁶中国科技大学生命科学学院，合肥，中国liuwj@im.ac.cn lj418@163.com。

PMID： 27122586
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内政部： 10.1128/JVI.00549-16

摘要

甲型流感和乙型流感病毒感染都会引起宿主先天免疫反应。在这里，我们报告了在早期感染期间，B型流感病毒而非A型流感病毒感染肺泡上皮（A549）细胞可诱导I型和III型干扰素（IFN）、IFN刺激的基因和促炎因子的大量产生。这种反应主要依赖于维甲酸诱导基因I（RIG-I）介导的信号通路。B型流感病毒的感染促进了RIG-I的强烈Lys63连接的泛素化，导致细胞因子爆发。众所周知，A型流感病毒NS1蛋白（NS1-A）与RIG-I和TRIM25相互作用，抑制RIG-I介导的信号的激活。然而，目前的结果表明，B型流感病毒NS1蛋白（NS1-B）不能与RIG-I相互作用，但参与形成RIG-I/TRIM25/NS1-B三元复合物。此外，我们证明NS1-B的N末端RNA-结合域（RBD）负责与TRIM25的相互作用，并且这种相互作用阻断了NS1-B C末端效应域（TED）对RIG-I泛素化的抑制作用。我们的发现揭示了宿主细胞因子通过宿主和病毒蛋白之间的调节相互作用对B型流感病毒感染作出反应的新机制。

重要性：B型流感病毒通常会引起局部轻度流行，但有时会对个人致命。现有研究描述了B型流感病毒流行病学和病理学的广泛特征。然而，为了更好地预防和治疗该病，确定发病的具体分子机制成为了解宿主如何应对B型流感病毒挑战的关键。因此，我们旨在描述宿主对B型流感病毒感染的固有免疫反应。在这里，我们表明，病毒感染可诱导RIG-I的Lys63连锁泛素化和依赖于RIG-I介导的信号转导的细胞因子爆发。此外，TRIM25通过阻断NS1-B对RIG-I泛素化的抑制功能，积极调节RIG-I介导的信号传导。

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数字

图1
乙型流感病毒感染阻断了重复感染。A549细胞感染B/Lee（MOI=0.5）。8小时后，用PBS冲洗细胞一次，并感染A/CA04（MOI=0.5）。在指定的时间提取细胞裂解物，并通过双茚二酸（BCA）蛋白质分析进行量化。将相同数量的样品加载到凝胶上，用抗NP-A/CA04、抗NS1-A/CA04或抗NP-B抗体进行免疫印迹（IB）分析。h.p.i，感染后小时。

图2
B型流感病毒感染可激活IFN、ISG和促炎因子的产生。（A和B）A549细胞在指定时间内以0.5的MOI感染B/Lee或A/CA04。通过实时PCR检测细胞中NP和NS1（A）以及IFN-β、IL-28A、IL-28 B、IL-29、IL-6、IL-8、ISG56和MxA（B）的表达。（C）收集上清液，并通过ELISA检测IFN-β和IL-29。错误栏指示SD。

图3
RIG-I介导的信号通路决定了细胞因子对乙型流感病毒感染的反应。（A）用B/Lee（MOI=0.5）或A/CA04（MOI=0.5）感染A549细胞，并在指定时间收集TRIzol中的细胞溶液或裂解缓冲液中的细胞裂解液。通过实时PCR计算RIG-I的基因表达水平。（B） A549细胞感染B/Lee（MOI=0.5）或A/CA04（MOI=0.5），并在指定时间收集细胞裂解物。进行BCA蛋白分析，然后进行IB分析，以分析RIG-I、NP-B、NS1-B、NP-A、NS1-A和GAPDH的蛋白水平。（C）通过密度测定法量化面板B中显示的RIG-I蛋白水平，并将其归一化为GAPDH。（D）用ISRE-luciferase或NF-κB-荧光素酶质粒以及β-Gal转染293T细胞。测定所示时间B/Lee感染或A/CA04感染的荧光素酶和β-Gal值。数据表示平均值和SD(n个= 3). （E） 293T细胞或*钻机-I*^−/−293T细胞以0.5的MOI感染B/Lee，并在指定的时间收集细胞裂解物。所有样本均采用BCA蛋白定量分析进行测试，然后采用抗RIG-I、抗P-p65、抗p65、防P-IRF3、抗IRF3，抗P-STAT1、抗STAT1，抗NP-B和抗β-肌动蛋白抗体进行IB分析。（F）实时PCR检测293T细胞中IFN-β、IL-28A、IL-2HB、IL-29、MxA和ISG56的相对基因表达水平*钻机-I*^−/−293T细胞。数据表示平均值和SD(n个= 3).

图4
B型流感病毒感染主要在感染早期通过K63连接的多泛素链促进RIG-I泛素化。（A）以0.5的MOI感染B/Lee和A/CA04细胞4h，收获分离线粒体。用BCA蛋白定量分析检测不含线粒体（Cyto）和线粒体（Mito）组分的细胞质，然后用抗RIG-I、抗TRIM25、抗NS1-B、抗NS1-A、抗VDAC1、，和抗GAPDH抗体。（B）面板A中显示的细胞和线粒体组分中的RIG-I和TRIM25蛋白水平通过密度测定法进行量化，并归一化为GAPDH或VDAC1。误差条表示标准误差（SE）。控制，控制。（C）用FLAG-RIG-I或FLAG以及HA-Ub转染293T细胞。24 h后，以0.5的MOI感染B/Lee或A/CA04细胞4 h。收集细胞裂解液，用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP），然后收集IB，用抗HA、抗FLAG、抗NS1-B、抗NS1-A/CA04或抗β-肌动蛋白抗体。（D）用FLAG-RIG-I和HA-Ub、HA-Ub-K48R或HA-Ub-K63R转染293T细胞24小时，然后用B/Lee（MOI=0.5）感染4小时。收集细胞裂解物，用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后用抗HA、抗FLAG或抗NS1-B抗体进行IB。（E）在用HA-Ub和FLAG-RIG-I或FLAG转染后24小时，293T细胞被B/Lee感染（MOI=0.5）。在指定的时间采集全细胞裂解物，并使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后使用抗HA、抗FLAG、抗NS1-B或抗β-肌动蛋白抗体进行免疫沉降。

图5
NS1-B通过与TRIM25相互作用参与RIG-I/TRIM25/NS1-B三元配合物。（A）在MOI为0.5时用B/Lee感染A549细胞。在指定的时间点，收集细胞裂解物并用BCA蛋白检测试剂盒进行定量。用抗TRIM25抗体免疫印迹法检测TRIM25的含量。（B）将FLAG-TRIM25转染293T细胞24小时，然后以0.5的MOI感染B/Lee，感染时间为指定时间。用荧光显微镜和抗FLAG单克隆抗体和抗NS1-B多克隆抗体测定FLAG-TRIM25（绿色）和NS1-B（红色）的定位。细胞核用DAPI染色。白色箭头表示粒状骨料。（C）用FLAG-RIG-I、Myc-TRIM25、Myc-NS1-B或两者转染293T细胞36小时。用抗FLAG对所有样品的全细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用抗FLAG、抗Myc和抗NS1-B抗体进行IB沉淀。（D）将FLAG-TRIM25转染293T细胞24小时，然后以0.5的MOI感染B/Lee细胞4小时。收集细胞裂解物，用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后用抗FLAG和抗NS1-B抗体进行IB。（E）将转染FLAG-RIG-I或FLAG的293T全细胞裂解物与Myc-NS1-B或Myc-NS1-1A（NS1-A/CA04和NS1-A/WSN）共转染24 h，用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后用IB进行抗FLAG和抗Myc抗体的免疫沉淀。（F）将293T细胞的全细胞裂解物转染Myc-NS1-B或Myc-NS1-1-A（NS1-A/CA04和NS1-A/WSN）48 h，并与GST-RIG-I或GST混合用于GST下拉（GST-PD），然后是带有抗Myc抗体或考马斯染色的IB。M、蛋白质标记物。

图6
NS1-B的N末端负责与RIG-I/TRIM25/NS1-B三元复合物中的TRIM25相互作用，这种相互作用抵消了NS1-B C末端对RIG-I泛素化的抑制能力。（A）编码与全长NS1-B或NS1-B截短体融合的Myc的构建体的示意图。（B）通过荧光显微镜评估TRIM25和NS1-B或NS1-B截短物的颜色化。将FLAG-TRIM25和Myc-NS1-B或Myc-NS1-B截短片段共转染到293T细胞中24 h，然后用抗FLAG（绿色）和抗Myc（红色）抗体染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。白色箭头表示粒状骨料。（C）将FLAG-TRIM25与编码全长NS1-B或NS1-B截短片段的构建物共转染到293T细胞中24小时。用抗FLAG抗体对全细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用抗体FLAG和抗Myc抗体对IB进行免疫沉淀。（D）用抗HA、抗FLAG和抗Myc抗体的免疫沉淀和免疫印迹分析证实了编码全长NS1-B或NS1-B截短的结构对RIG-I泛素化的影响。（E）通过密度测定法对全长NS1-B和NS1-B截断过度表达的相对RIG-I泛素水平（面板D中从左起第4至第8车道）进行量化，并将其归一化为相应的全长NS1-B或NS1-B截截。误差条代表SE。

图7
TRIM25、RIG-I和NS1-B之间相互作用的拟议模型。B型流感病毒感染后，TRIM25介导的RIG-I泛素化促进IFN、ISG和促炎因子的爆发。宿主细胞利用TRIM25与NS1-B（N-NS1-B）的N端RBD相互作用，并减轻NS1-B C端TED（C-NS1-B。

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[8] Hoffmann E、Mahmood K、Yang CF、Webster RG、Greenberg HB、Kemble G.2002。从八个质粒中拯救B型流感病毒。美国国家科学院院刊99:11411–11416。doi:10.1073/pnas.172393399。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[10] Almond JW，Haymerle HA，Felsenreich VD，Reeve P.1979。B型流感病毒的结构和感染细胞多肽。《Virol Gen杂志》45:611–621。doi:10.1099/0022-1317-45-3-611。-内政部-公共医学

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