跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2016年7月1日；311（1）：C43-53。
doi:10.1152/ajpcell.00080.2016。 Epub 2016年4月27日。

Ste20激酶SPAK和OSR1通过外泌体在细胞间旅行

Rainelli Koumangye公司 1, 埃里克·德尔皮雷 2
附属公司

Ste20激酶SPAK和OSR1通过外泌体在细胞间旅行

Rainelli Koumangye公司等。 美国生理学杂志细胞生理学. .

摘要

蛋白质组学研究已在从血液、唾液和尿液等体液中分离的外泌体中鉴定出与Ste20相关的脯氨酸/丙氨酸丰富激酶（SPAK）和氧化应激反应1（OSR1）。由于蛋白质组学研究可能高估了胞外体蛋白的数量，我们试图用传统的生物化学和细胞生物学方法来证实和扩展这一观察结果。我们利用培养中的HEK293细胞验证这些Ste20激酶在外泌体中的包装。使用从HEK293细胞分离的条件培养基的一系列离心和过滤步骤，我们分离出40-100nm范围内的纳米囊泡。我们发现这些小泡表达四跨蛋白CD63，缺乏内质网和高尔基体标记物，这与这些外泌体一致。我们通过蛋白质印迹和免疫金分析表明，这些外泌体表达SPAK、OSR1和Na-K-Cl协同转运蛋白1（NKCC1）。我们发现，外泌体不仅由细胞分泌，而且由邻近细胞积累。事实上，将培养细胞暴露于表达荧光标记激酶的其他细胞产生的外泌体中，导致激酶进入这些细胞的细胞质，这与外泌物作为细胞间通讯血管的想法一致。同样，共同培养表达不同荧光标记蛋白的细胞会导致细胞之间的蛋白质交换。此外，我们发现通过外泌体进入细胞的SPAK和OSR1激酶都优先在质膜上表达，外泌体内的激酶具有功能性，并将NKCC1维持在磷酸化状态。

关键词：HEK293细胞；HeLa细胞；NKCC1；Na-K-2Cl共转运；细胞外小泡。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
外泌体的分离。图示为用于从HEK293细胞条件培养基中纯化外泌体的差速离心方案。
图2。
图2。
SPAK和OSR1存在于外泌体中。A类：HEK293外泌体的典型透射电镜图像。条形，500 nm。B类：通过超速离心从HEK293细胞条件培养基中纯化外泌体。用Western blotting分析了10微克。在胞外体部分检测到OSR1和SPAK以及胞外体标记EGFR和CD63，而高尔基体（58K）和ER（PDI）标记仅在细胞裂解物部分检测到。OSR1和SPAK印迹用于探测HEK293中的裂解物和外泌体。C类：转染HA-SPAK和FLAG-OSR1的HEK293细胞将外源性SPAK和OSR1封装在外泌体内。从表达HA-SPAK和FLAG-OSR1的HEK293细胞的条件培养基中纯化外显子，并通过Western blotting进行分析。OSR1和SPAK印迹检测HEK293的裂解物和外泌体，表达天然和重组标记的FLAG-OSR1及HA-SPAK。
图3。
图3。
外体部分SPAK和OSR1的确认。稳定转染FLAG-OSR1和HA-SPAK的HEK293细胞条件培养基中的外显子在不连续（0.25M/2.0M/2.5M）蔗糖梯度上进行分离。利用SDS-PAGE分离从蔗糖梯度顶部（50μl）收集的组分，并通过Western blotting分析是否存在OSR1、SPAK、NKCC1和胞外体标记CD63。
图4。
图4。
SPAK和OSR1位于含有膜的囊泡内。A类：蔗糖梯度纯化的外泌体未经处理（Exo；车道2)，与胰蛋白酶孵育30分钟（Exo+胰蛋白酶；车道3)或与0.1%Triton X-100孵育5分钟，然后进行胰蛋白酶处理（Exo+TX+胰蛋白酶，车道4).车道1以30μg HEK293细胞裂解液作为对照。B类和C类：蔗糖梯度纯化的外泌体固定在碳网格上，用Triton渗透，分别用兔抗SPAK和抗OSR1标记，并用蛋白A-金结合物检测。然后用乙酸铀酰对外显子进行染色，并在电子显微镜下观察。棒材，100 nm。
图5。
图5。
利用胞外体CD63标记对OSR1和NKCC1进行克隆化。HeLa细胞与GFP-CD63和tdTomato-NKCC1瞬时共转染(A类)或GFP-CD63和tdTomato-OSR1(B类). 48小时后，用4%多聚甲醛固定细胞，并用带DAPI的ProLong Gold防褪色试剂将其安装在玻璃盖玻片上。Z轴叠加图像是在蔡司LSM710共焦显微镜上拍摄的。带有绿色和红色滤镜合并图像（同位化）的图像显示在正确的.棒材，10μm。
图6。
图6。
HEK293细胞将提供给其细胞外环境的外泌体内化。A类：从细胞中分离出来并被其他细胞内化的外泌体的示意图。B类：将从过度表达Venus-OSR1的HEK293细胞中收集的外显子转移到三个单独的MatTek培养皿中，培养皿中含有瞬时表达tdTomato-NKCC1的HEK2903细胞，并对每个平板的三个视野进行成像。通过活细胞共聚焦显微镜观察静脉内皮细胞的内部化。注意绿色细胞和橙色细胞的数量，它们决定了含有OSR1的外泌体的静脉内化。棒材，10μm。
图7。
图7。
在HEK293细胞中Cerulean-OSR1在细胞间的转移。A类：用tdTomato-NKCC1或Cerulean-OSR1转染HEK293细胞，分离、混合并在新培养皿中共培养。B类：HEK293细胞的活显微镜照片，显示红色和绿色信号。强绿色细胞(右上角)用Cerulean-OSR1成功转染，而显示淡绿色信号的细胞（标记为“1”）是由Cerulean-OSR1转染的细胞产生的外泌体的受体细胞。显示淡红色信号的细胞（标记为“2”）是由tdTomato-NKCC1转染的细胞产生的外泌体的受体细胞。在膜上显示橙色信号，包括黄色信号（箭头）的细胞是接受了Cerulean-OSR1外泌体的tdTomato转染的细胞。C类和D类：相同的照片分别显示红色和绿色信号。每次转染都被放置在3个MatTek培养皿上，每个培养皿都有3个视野成像。实验重复一次。棒材，10μm。
图8。
图8。
在HEK-293细胞中从细胞向细胞转移静脉SPAK。A类：用tdTomato-NKCC1或Venus-SPAK转染HEK293细胞，分离、混合并在新培养皿中共培养。B类：HEK293细胞的活显微镜照片，显示红色和绿色信号。用Venus-SPAK成功转染强绿色细胞，而显示淡绿色信号（标记为“1”）的细胞是由Venus-SPAK转染细胞产生的外泌体的受体细胞。显示淡红色信号的细胞（标记为“2”）是由tdTomato-NKCC1转染细胞产生的外显体的受体细胞。显示橙色/黄色信号的细胞是接受了Venus-SPAK外泌体的tdTomato转染细胞。C类和D类：相同的照片分别显示红色和绿色信号。箭头指向质膜。每次转染都被放置在3个MatTek培养皿上，每个培养皿都有3个视野成像。实验重复一次。棒材，10μm。
图9。
图9。
外泌体激酶活性高，磷酸化NKCC1。A类：通过SDS-PAGE分离增加的外泌体和细胞裂解物对照，并通过Western blotting分析磷酸化-NKCC1和总NKCC1信号。外泌体内包装的NKCC1被外泌体内的OSR1/SPAK磷酸化。B类：外泌体中的OSR1和SPAK磷酸化细胞NKCC1。用HEK293细胞裂解液中的免疫沉淀NKCC1孵育HEK293exosome裂解液，在37°C孵育45分钟，然后对磷酸化NKCC1和总NKCC1信号进行Western blot分析。
图10。
图10。
外泌体中膜蛋白的极性可通过外泌体形成来解释。该过程始于质膜出芽进入早期内体(1)在某些情况下可以再循环回膜(2). 在其他情况下，早期内体与晚期内体融合(三). 晚期内体膜的萌芽产生多泡体(4). 这些多泡体与质膜的融合将外泌体释放到细胞外空间(5). SPAK/OSR1激酶（如图中的小绿点所示）可以在细胞中发现，与质膜蛋白结合（在膜上画有绿点的转运蛋白），也可以在胞浆中发现。注意，细胞溶质蛋白仅在出芽过程中通过扩散被捕获在外泌体中。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Alvarez-Leefmans FJ。突触前抑制、疼痛和神经源性炎症中的氯化物转运体。摘自：《神经系统氯离子转运蛋白和通道的生理学和病理学：从分子到疾病》，Alvarez-Leefmans FJ编辑，Delpire E.London:学术，2009年，第439-470页。
    1. Carayon K、Chaoui K、Ronzier E、Lazar I、Bertrand-Michel J、Roques V、Balor S、Terce F、Lopez A、SaloméL、Joly E。网织红细胞成熟过程中，外源体的蛋白质组分发生变化。生物化学杂志286:34426–344392011。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Collaco AM、Jakab RL、Hoekstra NE、Mitchell KA、Brooks A、Ameen NA。哺乳动物Brunner腺体中阴离子转运蛋白的调节交通：水和液体运输的作用。《美国生理学杂志》胃肠道试验肝脏生理学305:G258–G275，2013年。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Colombo M、Raposo G、Théry C.外体和其他细胞外囊泡的生物发生、分泌和细胞间相互作用。《细胞发育生物学年鉴》30:255-2892014。-公共医学
    1. Delpire E.类固醇20p样蛋白激酶的哺乳动物家族。普法吕格拱门458:953–9672009。-公共医学

MeSH术语