A polybasic motif in ErbB3-binding protein 1 (EBP1) has key functions in nucleolar localization and polyphosphoinositide interaction

doi:10.1042/BCJ20160274

.2016年7月15日；473(14):2033-47.

doi:10.1042/BCJ20160274。 Epub 2016年4月26日。

ErbB3结合蛋白1（EBP1）中的一个多碱基基序在核仁定位和多磷酸肌醇相互作用中具有关键功能

托马斯·卡尔森¹, Altanchimeg Altankhuyag山¹, 奥列娜·多布罗沃尔斯卡¹, 戴安娜·图尔库¹, 奥雷利亚·E·刘易斯²

附属公司

¹挪威卑尔根大学分子生物学系NucReg研究项目，5008卑尔根。
²挪威卑尔根大学分子生物学系NucReg研究项目，5008卑尔根aurelia.lewis@uib.no。

PMID： 27118868
预防性维修识别码：项目经理4941749
内政部： 10.1042/BCJ20160274

ErbB3结合蛋白1（EBP1）中的一个多碱基基序在核仁定位和多磷酸肌醇相互作用中具有关键功能

托马斯·卡尔森等。生物化学杂志. 2016.

.2016年7月15日；473（14）：2033-47。

doi:10.1042/BCJ20160274。 Epub 2016年4月26日。

作者

托马斯·卡尔森¹, Altanchimeg Altankhuyag山¹, 奥列娜·多布罗沃尔斯卡¹, 戴安娜·图尔库¹, 奥雷利亚·E·刘易斯²

附属公司

¹挪威卑尔根大学分子生物学系NucReg研究项目，5008卑尔根。
²挪威卑尔根大学分子生物学系NucReg研究项目，5008卑尔根aurelia.lewis@uib.no。

PMID： 27118868
预防性维修识别码：项目经理4941749
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摘要

多磷酸肌醇（PPIns）存在于细胞核中，参与染色质重塑、转录和mRNA处理等关键核过程。在之前的相互作用组学研究中，为了进一步了解核PPIns的功能，我们在脂质下拉筛选中确定ErbB3结合蛋白1（EBP1）为潜在的核PPIn结合蛋白。EBP1是一种普遍存在的保守蛋白，位于细胞质和核仁中，与细胞增殖和生存相关。在本研究中，我们发现EBP1通过由赖氨酸残基簇组成的两个不同的PPIn结合位点直接与多个PPIn相结合，并定位在蛋白质的N-和C-末端。利用相互作用突变体，我们发现C末端PPIn结合基序对EBP1在核仁中的定位贡献最大。重要的是，位于子宫内膜肿瘤中的C末端基序内的K372N点突变足以改变EBP1的核仁靶向性。我们的研究还揭示了核仁中存在I类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）催化亚单位p110β及其产物PtdIns（3,4,5）P3和EBP1。利用核磁共振，我们进一步证明了EBP1和PtdIns（3,4,5）P3之间通过静电和疏水相互作用的关联。综上所述，这些结果表明EBP1直接与PPIns相互作用，并与核仁中的PtdIns（3,4,5）P3结合。核仁中p110β和PtdIns（3,4,5）P3的存在表明了它们在调节核仁过程中的潜在作用，至少通过EBP1。

关键词：EBP1；PI3K；PIP3；交互作用；核仁；p110β。

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数字

**图1。EBP1与磷酸肌醇结合**
(A类)分离、洗涤MEL细胞核，并在RT时在不含（−）或含（+）5 mM新霉素的保留缓冲液中培养30分钟。用Western免疫印迹法分析上清液。(B类)显示斑点脂质位置的PIP条示意图(www.echelon-inc.com). 溶血磷脂酸；溶血磷脂酰胆碱；磷脂酰肌醇；PE，磷脂酰乙醇胺；磷脂酰胆碱；S1P，1-磷酸鞘氨醇；PA，磷脂酸；PS，磷脂酰丝氨酸。(C类)与重组GST-融合蛋白（EBP1-FL WT、PLC-δ1-PH和GRP1-PH结构域）孵育的PIP条，并使用抗GST-HRP结合抗体检测蛋白质-脂质相互作用。(D类)来自四个单独实验的结合信号的量化显示为与背景信号相关的密度比的平均值+S.D。(E类)在含有150–400 mM NaCl的TBS-T中与GST-EBP1 FL孵育的PIP条，并使用抗GST-HRP结合抗体检测蛋白质-脂质相互作用。(F类)来自两个单独实验的结合信号的量化，显示为密度比（300/150）的平均值+S.D.，每个与背景信号相关。

**图2。EBP1含有PPIn相互作用所需的两个富含赖氨酸的PBR**
(A类)EBP1的C-末端富含赖氨酸的PBR与其他核PIP-结合蛋白的比对。(B类)EBP1氨基酸1–361的3D结构和N-末端富含赖氨酸的PBR环（pdb 2Q8K）的位置。(C类)重组GST-EBP1 FL、N末端（N末端）和C末端（C末端）结构的表示，以及两个富含赖氨酸的PBR及其突变体的近似位置，以红色突出显示(D类)PIP条与重组GST-EBP1蛋白（FL、N-和C-末端）、WT或以下富含赖氨酸的PBR突变体、N-K3A（K65A–K66A–K68A）、C-K4A（K369A–K370A–K371A–K372A）和N-K3A/C-K4A组合突变体孵育。使用抗GST-HRP结合抗体检测蛋白质-脂质相互作用。

**图3。EBP1通过其C-末端富含赖氨酸的PBR定位于核仁**
(A类)AU565细胞与抗EBP1和抗NPM抗体共同染色，并通过共焦显微镜成像。5μmol标尺。(B类)人类EBP1的假定NoLS序列和C项富K PBR的比对。(C类)转染EGFP-C2-EBP1 WT和突变FL构建物的AU565细胞，用抗NPM染色并通过外荧光显微镜成像。比例尺均为10μmol。(D类)至少来自三个不同实验的EGFP-EBP1 WT和突变体定位模式的量化+S.D(E类)转染EGFP-C2-EBP1 WT和突变FL构建物后获得的AU565细胞提取物的Western免疫印迹。

**图4。铂族锡（3,4,5）*P（P）*_三定位于核仁**
(A类)用NLS-EGFP或NLS-EGFP-GRP1-PH转染AU565细胞，并与10μmol LY-294002孵育，用抗核仁素染色并通过表观荧光成像。(B类)来自三个不同实验的NLS-EGFP-GRP1-PH核仁定位的量化+S.D(C类)用抗PtdIns（3,4,5）孵育的七种PPIn中的每种发现1.56–100 pmol的PIP阵列*P（P）*_三和抗鼠HRP结合抗体。(D类)AU565细胞与抗核仁蛋白和抗PtdIns（3,4,5）共同染色的共聚焦图像*P（P）*_三抗体。(E类)AU565与抗p110β和抗NPM抗体共同染色的共聚焦图像。比例尺均为5μmol。

**图5。EBP1与PtdIns（3,4,5）部分共定位*P（P）*_三**
(A类)AU565细胞与抗EBP1和抗PtdIns（3,4,5）共同染色*P（P）*3个抗体并通过共焦显微镜成像。(B类)PIP试纸条与透析的新粘菌素蛋白提取物孵育，仅检测到抗兔HRP抗体（-）或抗EBP1和抗兔HRP抗体（+）的蛋白-脂质相互作用。(C类)通过SDS/PAGE解析透析的新肌球蛋白沉积蛋白提取物（20μg），并用抗EBP1抗体进行免疫印迹。

**图6。EBP1 C末端结构域与PtdIns（3,4,5）相互作用的NMR表征*P（P）*_三**
(A类)¹H–¹⁵GST-C末端EBP1的N HSQC指纹图谱（蓝色）。指定的NH交叉峰用一个字母的氨基酸代码和序列号标记。源于GST标签和EBP1目标序列之间的连接序列的残基被标记为绿色并用星形标记。根据EBP1序列维持CTD前连接子区域的氨基酸编号。(B类)使用指定EBP1残基的组合Cα和Cβ化学位移值计算SSP得分。容易形成α-螺旋的残基得分为正，SSP得分为负的残基容易占据β-片或扩展环。完全形成的α-螺旋和β-片中的残留物的得分分别为1和-1。(C类)叠加¹H–¹⁵N在不存在（蓝色）和存在diC16-PtdIns（3,4,5）的情况下获得的C末端EBP1的HSQC光谱*P（P）*_三（红色）。(D类)加入PtdIns（3,4,5）后信号强度变化*P（P）*_三根据面板C中的结果计算EBP1残留物(E类)叠加¹H–¹⁵在不存在（蓝色）和存在diC8 PtdIn（3，4，5）的情况下获得的C端EBP1的N个HSQC光谱*P（P）*_三（红色）。(F类)加入PtdIns（3,4,5）后信号强度变化*P（P）*_三根据面板E中的结果计算EBP1残基。绿色条表示来自C末端PBR的赖氨酸。

**图7。肿瘤相关EBP1突变体K372N阻止其核仁定位**
(A类)野生型富含K的C-末端基序与K372N突变体的比对。(B类)用EGFP-C2-EBP1 K372N突变FL构建物转染AU565细胞，用抗NPM染色，并用表观荧光显微镜（5μmol标尺）成像。(C类)PIP条与C末端结构域GST-EBP1 WT和K372N蛋白孵育，并使用抗GST-HRP结合抗体检测蛋白质-脂质相互作用。(D类)结合信号的量化如(C类)K372N/WT密度比的平均值+S.D。

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