Platelet-cytokine Complex Suppresses Tumour Growth by Exploiting Intratumoural Thrombin-dependent Platelet Aggregation

doi:10.1038/srep25077

.2016年4月27日：6:25077。

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血小板细胞因子复合物通过利用肿瘤内凝血酶依赖性血小板聚集抑制肿瘤生长

李宇通¹, 西川友久¹, 金田康夫¹

附属公司

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预防性维修识别码：项目经理4846878
内政部： 10.1038/srep25077

血小板细胞因子复合物通过利用肿瘤内凝血酶依赖性血小板聚集抑制肿瘤生长

李宇通等。科学代表. 2016.

.2016年4月27日：6:25077。

doi:10.1038/srep25077。

作者

李玉东¹, 西川友久¹, 金田康夫¹

附属

¹大阪大学医学研究生院基因治疗科学部，日本大阪。

采购管理信息： 27117228
预防性维修识别码：项目经理4846878
内政部： 10.1038/srep25077

摘要

肿瘤构成独特的微环境，在这里，由于血管系统的泄漏，各种血细胞和因子被暴露出来。在本研究中，我们报告了B16F10黑色素瘤中凝血酶的富集导致血小板聚集，并且利用这一特性通过形成血小板-IP10复合物来给药抗癌细胞因子干扰素-γ诱导蛋白10（IP10）。当静脉注射时，复合物在肿瘤中达到血小板微聚集。复合物诱导的反应是单纯免疫介导的，未观察到肿瘤细胞毒性。复合物在体内抑制小鼠黑色素瘤的生长，而血小板和复合物都抑制了FoxP3（+）调节性T细胞在肿瘤中的积聚。这些结果表明，B16F10肿瘤中凝血酶依赖性血小板聚集将血小板定义为传递抗癌细胞因子并提供特定治疗益处的载体。

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数字

**图1。B16F10黑色素瘤中活性凝血酶升高，血管附近检测到血小板聚集。**
(一)使用SensoLyte试剂盒测量血浆、B16F10新鲜均质组织和皮肤的凝血酶活性。n个 = 3只老鼠。误差条，SD.****p<0.001. 单向方差分析（ANOVA），然后进行邓内特测试。(b条)对整个B16F10肿瘤（上面板）或肾脏样本（下面板）的切片进行凝血酶裂解（红色）和CD31（绿色）染色，并使用共焦显微镜进行检查。比例尺 = 100 微米。(**c（c）**)测定肿瘤和各种正常器官组织切片的凝血酶活性，并将其归一化为组织体积。n个 = 4只小鼠***第页<0.005，****磅<0.001. 单向方差分析（ANOVA），然后进行邓内特测试。(d日)凝血酶在B16F10（上面板）和未受影响皮肤（下面板）周围组织中的分布。白色虚线表示肿瘤边界。比例尺 = 100 微米。(**e（电子）**)B16F10肿瘤中血管系统（CD31，红色）和血小板聚集物（CD41，绿色）之间的相对定位。箭头表示容器关联聚合，箭头表示容器相关聚合。比例尺 = 100 微米。(**（f）**)共检测了7例肿瘤中174簇瘤内血小板聚集物与血管系统的空间关系。误差线，SEM。

**图2。血小板中IP10的合并和释放。**
(一)新鲜血小板与rm-IP10在37℃的mTyrode缓冲液中孵育摄氏度。在时间点分离血小板，并通过ELISA测定IP10的裂解物。n个 = 3.NT，不治疗；NT-2型小时，NT在37孵育 2°C 小时(b条)血小板-IP10复合物在有或无渗透性的情况下进行IP10（红色）染色，并使用阴茎倍体蛋白（绿色）进行复染。比例尺 = 20 微米。100倍的目标。(**c（c）**)检测了100多个复合物，并列举了IP10信号****第页<0.0001. 学生的t吨-测试。(d日,**e（电子）**)用缓冲液、抗CD41或抗CD41加凝血酶处理复合物。测定释放的PDGF含量(d日)和IP10(**e（电子）**)使用ELISA。n个 = 3. (**（f）**)通过增加凝血酶浓度刺激复合物，并使用ELISA检测IP10的释放。n个 = 3.误差条，SEM.nd，未检测到，*p<0.05，***p<0.005之间。单向方差分析（ANOVA），然后进行Dunnett检验（针对(一,d日,**e（电子）**))或者Tukey的测试(**（f）**)已执行。

**图3。血小板-IP10复合物的肿瘤靶向性。**
(一)连续三天通过尾静脉将血小板或血小板-IP10复合物或PBS静脉注射到B16F10荷瘤小鼠体内。对肿瘤切片进行血小板聚集物（CD41，绿色）和IP10（红色）染色。箭头显示血小板-IP10复合物聚集的例子（黄色）。比例尺，100 微米。(b条,**c（c）**)荷瘤小鼠腹腔注射阿加曲班或PBS。PFA灌注肿瘤组织染色CD31（红色）和CD41（绿色）。10×目标。n个 = 4只小鼠。比例尺 = 100 微米*第页<0.05. 学生的t吨-测试。(d日)将PKH67标记的血小板与阿加曲班（arga）或PBS注射到预先处理的肿瘤中。PBS中血小板微聚集体的大小（n = 237）和argatroban（n = 113）-对治疗过的肿瘤进行了测量。(**e（电子）**)在2 在单次静脉注射治疗数小时后，采集肿瘤并使用ELISA测定肿瘤内生物素化IP10。n个 = 每组4-9个肿瘤。nd，未检测到，*p<0.05，****页<0.001. 曼·希特尼U型-测试(d日,**e（电子）**). 误差线，SEM。

**图4。血小板-IP10复合物的抗肿瘤作用体内.**
(一)处理计划示意图（Sch）。每个区块代表一个每日单位，箭头代表正在进行的监测(b条)肿瘤接种后14天和20天B16F10肿瘤的体积。n个 = 每组5只小鼠。(**c（c）**)对7天大的皮下B16F10肿瘤小鼠进行的肿瘤生长时间过程研究表明需要静脉注射治疗。n个 = 每组10-12只小鼠。误差线，SEM.*p<0.05. 单因素方差分析之后是年的Dunnett检验(b条,**c（c）**). (d日)在肿瘤接种后22天，将血小板-IP10治疗组的肿瘤体积与血小板对照组的肿瘤体积进行比较。数据汇集自(**c（c）**)和另外两个独立的实验。n个 = 每组21–22只小鼠**第页<0.01. 曼·希特尼U型-测试。

**图5。血小板-IP10复合物诱导的细胞免疫反应体内.**
用B16F10细胞接种小鼠，并按照附表A进行治疗，如图4a所示。用含有2%FBS的0.5%胶原酶消化切除的肿瘤，直到分离。对细胞内免疫细胞进行CD4、CD8和CD49b染色(一)和FoxP3(b条)CD45门控⁺并用流式细胞仪进行分析。在(**c（c）**)、FoxP3的比率⁺至FoxP3⁻显示单元格。n个 = 4-5个肿瘤。ns，不显著，***p<0.005之间。在整个图中，使用了单向方差分析和Dunnett检验。

**图6。血小板调节FoxP3的表达。**
(一)脾细胞与缓冲液或血小板共培养24（n = 7–10）或48 小时（n = 3–7）在有或无凝血酶的情况下，使用qRT-PCR分析foxp3的表达。(b条)脾细胞按(一)用于48 使用流式细胞术分析凝血酶存在时FoxP3的表达。n个 = 9–10.误差条，扫描电镜。***p<0.0005. 学生的t吨-测试。

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