In Vivo Selection Yields AAV-B1 Capsid for Central Nervous System and Muscle Gene Therapy

doi:10.1038/mt.2016.84

.2016年8月；24(7):1247-57.

doi:10.1038/mt.2016.84。 Epub 2016年4月27日。

体内选择产生用于中枢神经系统和肌肉基因治疗的AAV-B1衣壳

附属机构

¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院神经病学系。
²美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院基因治疗中心。
^三美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经病学系和神经科学项目。
⁴美国马里兰州巴尔的摩市约翰·霍普金斯医学院雨果·莫瑟研究所、肯尼迪·克里格研究所、神经病学和神经科学系。
⁵美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院眼科。
⁶美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院糖尿病卓越中心。
⁷美国阿拉巴马州奥本市奥本大学兽医学院斯科特·里奇研究中心。
⁸美国阿拉巴马州奥本市奥本大学兽医学院临床科学系。
⁹美国马萨诸塞州剑桥市旅行者治疗公司。
¹⁰美国阿拉巴马州奥本市奥本大学兽医学院解剖学、生理学和药理学系。

采购管理信息： 27117222
PMCID公司： PMC5088762
内政部： 10.1038/mt.2016.84

体内选择产生用于中枢神经系统和肌肉基因治疗的AAV-B1衣壳

Sourav R Choudhury公司等。分子治疗. 2016年8月.

.2016年8月；24(7):1247-57.

doi:10.1038/mt.2016.84。 Epub 2016年4月27日。

附属机构

¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院神经病学系。
²美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院基因治疗中心。
^三美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院神经病学系和神经科学项目。
⁴美国马里兰州巴尔的摩市约翰·霍普金斯医学院雨果·莫瑟研究所、肯尼迪·克里格研究所、神经病学和神经科学系。
⁵美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院眼科。
⁶美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院糖尿病卓越中心。
⁷美国阿拉巴马州奥本市奥本大学兽医学院斯科特·里奇研究中心。
⁸美国阿拉巴马州奥本市奥本大学兽医学院临床科学系。
⁹美国马萨诸塞州剑桥市旅行者治疗公司。
¹⁰美国阿拉巴马州奥本市奥本大学兽医学院解剖学、生理学和药理学系。

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摘要

腺相关病毒（AAV）载体有望成为神经疾病基因治疗的平台。实现向中枢神经系统（CNS）的全球基因传递是开发许多此类疾病的有效治疗方法的关键。在这里，我们报道了从AAV衣壳文库中进行一轮体内筛选后，分离出一种新的中枢神经系统嗜酸性AAV衣衣壳，AAV-B1。在成年小鼠和猫体内系统注射AAV-B1载体，导致在整个CNS中广泛的基因转移，并转导多个神经元亚群。此外，AAV-B1高效地转导肌肉、β细胞、肺泡和视网膜血管。该载体在向小鼠大脑、脊髓、肌肉、胰腺和肺传递基因方面比AAV9更有效。与AAV9相比，AAV-B1在中枢神经系统基因治疗中的广泛转导特征，再加上对混合人类血清中抗体中和的敏感性降低，是一项重要的改进。

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数字

图1
**单轮体内生物淘洗**. (一)选择策略。(**b、 c（c）**). 亲本衣壳蛋白基因对新嵌合衣壳基因的贡献(b条)大脑（AAV-B1、-B2、-B3和-B4）和(**c（c）**)肝脏。(**d、 e（电子）**)从中分离的衣壳的氨基酸同源性(d日)大脑和(**e（电子）**)肝脏。灰色区域表示同源；黑线表示非同源氨基酸。%计算氨基酸组成的同源性。

图2
**成年小鼠血管内输注AAV-B1载体后的中枢神经系统转导谱**. (一)AAV-B1和AAV9注射小鼠脑内绿色荧光蛋白（GFP）分布概述（2 × 10¹²vg/鼠标）。位于+0.5、−1.80和−3.00的冠状脑切片的代表性图像所示为mm（从左到右）相对于短角。(b条)AAV-B1-和AAV9-注射小鼠不同CNS区域神经元群的转导。黑色箭头表示通过形态学鉴定的GFP阳性神经元。棒材=50µm。

图3
**AAV-B1中枢神经系统转导效能的定量评估**. (一)定量注射AAV-B1-GFP或AAV9-GFP载体的小鼠运动皮层、纹状体和丘脑中绿色荧光蛋白（GFP）阳性神经元的百分比，以及胸椎脊髓中GFP阳性运动神经元的百分比。所示数据为平均值±SD(n个=每组4个生物重复）。(**b、 c（c）**)的比较(b条)AAV载体基因组含量和(**c（c）**)注射5 × 10¹¹vg AAV-B1或AAV9(N个=每组4只动物）。将年龄匹配的未注射小鼠作为对照组（未显示）。将GFP的信号强度标准化为相应的β-肌动蛋白信号强度进行定量比较**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*<0.0001由学生的双尾非配对t吨-测试。

图4
**血管内给药后AAV-B1在小鼠其他组织中的生物分布**.绿色荧光蛋白（GFP）在(一)AAV-B1和AAV9注射小鼠的肝脏（2 × 10¹²vg/鼠标）(d日)骨骼肌（三头肌和四头肌）、横膈膜和心脏(**（f）**)胰腺(小时)肺，和(k个)AAV-B1注射小鼠的视网膜（5 × 10¹¹vg/鼠标）。白色箭头(**（f）**)表示GFP（绿色）阳性胰岛素（红色）产生的β细胞。插入(k个)显示单个GFP阳性血管。AAV载体基因组含量的比较(b条)肝脏(**e（电子）**)肌肉群(我)胰腺，和(j个)肺和GFP蛋白水平(**c（c）**)小鼠肝脏注射5 × 10¹¹显示vg AAV-B1或AAV9(N个=每组4只动物）。(克)β细胞（通过与胰岛素共定位鉴定）、外分泌细胞和导管细胞（通过形态学鉴定）的GFP+群体的百分比的定量**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*<0.0001由学生的双尾非配对t吨-测试。

图5
**AAV-B1载体在猫体内系统传递后对其他组织的神经转导和生物分布**. (一)全身给药3.4天后猫脑中绿色荧光蛋白（GFP）的分布 × 10¹²vg AAV-B1载体。典型图像显示脑内不同结构中具有神经元形态的GFP阳性细胞。三叉神经束图像显示神经纤维GFP染色。棒材=50µm。(b条)用抗GFP抗体和泛神经标记物NeuN的双重免疫荧光染色鉴定转导细胞。(**c（c）**)GFP在AAV-B1注射猫的肝脏、股四头肌和心脏中的表达。对照组包括年龄匹配的未注射猫。

图6
**AAV-B1的结构、结合和中和抗体分析**. (一)AAV-B1衣壳的预测分子模型。(b条)AAV-B1（左）和AAV8（右）的表面暴露可变区域-IV（VR-IV）。(**c（c）**)混合人免疫球蛋白-G中和试验和(d日)AAV-B1和AAV9载体的CHO细胞结合试验。数据显示为平均值±平均值标准误差(**c（c）**)，平均值±标准差(d日). 实验是用N个=3个生物复制**P（P）*经单因素方差分析，<0.05。

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