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.2016年8月1:304:121-32。
doi:10.1016/j.taap.2016.04.005。 Epub 2016年4月20日。

线粒体靶向芳香烃受体及2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英对细胞呼吸和线粒体蛋白质组的影响

Hye Jin黄 1, 彼得·多恩博斯 2, 米歇尔·斯特伊德曼 三, 泰勒·K·杜尼文 4, 迈克·里佐 5, 约翰·J·拉普雷斯 6
附属机构

线粒体靶向芳香烃受体及2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英对细胞呼吸和线粒体蛋白质组的影响

Hye Jin黄等。 毒理学应用药理学. .

摘要

芳基烃受体（AHR）是Per-Arnt-Sim（PAS）结构域超家族中的配体活化转录因子。暴露于最有效的AHR配体2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英（TCDD）与包括代谢综合征在内的各种病理效应相关。虽然过去几年的研究表明，氧化应激和代谢功能障碍在AHR-依赖性TCDD诱导的毒性中起到了一定作用，但线粒体在这一过程中的作用尚未得到充分探讨。我们以前的研究表明，AHR细胞池的一部分可以在线粒体（mitoAHR）中找到。使用含有洋地黄素提取物的蛋白酶保护试验，我们现在表明，这种丝裂原AHR定位于细胞器的膜间空间（IMS）。TCDD暴露诱导了与细胞溶质AHR类似的mitoAHR降解。此外，siRNA-介导的敲除表明线粒体外膜20的转座子酶（TOMM20）参与AHR导入线粒体。此外，TCDD以AHR依赖性方式改变细胞呼吸，以维持氧耗率（OCR）测量的呼吸效率。细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）鉴定了线粒体蛋白质组中受TCDD影响的一组蛋白质，这些蛋白质以AHR依赖的方式存在。其中，17个折叠变化≥2的蛋白质与各种代谢途径相关，提示线粒体逆行信号在TCDD介导的病理中的作用。总之，这些研究表明，mitoAHR定位于IMS，AHR依赖的TCDD诱导的毒性，包括代谢功能障碍、消瘦综合征和肝脂肪变性，涉及线粒体功能障碍。

关键词：2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英（TCDD）；芳香烃受体；线粒体；氧化磷酸化；蛋白质组学；SILAC公司。

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数字

图1
图1。线粒体亚室分析用于AHR定位
在暴露于不断增加的洋地黄素浓度（0.0-2.0 mg洋地黄碱/mg蛋白质）后，评估了从hepa1c7细胞分离的线粒体内胰蛋白酶对蛋白质的可及性。保留在线粒体颗粒中的蛋白质通过蛋白质印迹进行分析。TOMM20作为外膜标记物。DIABLO是一种膜间隙（IMS）定位蛋白。细胞色素c氧化酶亚基IV（COX4）是线粒体内膜蛋白，ATP5α是线粒体基质蛋白。显示的结果代表了三个独立的实验。
图2
图2。mitoAHR易受配体诱导降解的影响
Hepa1c7暴露于二甲基亚砜（0.01%）或TCDD（10 nM）6(A类)或24小时(B类). 分离的线粒体在没有（1、2、4和5巷）或存在洋地黄素（0.4 mg洋地黄蛋白/mg蛋白质，3和6巷）的情况下被胰蛋白酶化。通过Western blotting分析留在线粒体颗粒中的蛋白质。TOMM20作为外膜标记物。DIABLO是一种IMS定位蛋白。ATP5α是一种线粒体基质蛋白。细胞质蛋白质类(C类)纳入以评估TCDD诱导的AHR降解6或24小时的水平。α-微管蛋白是胞质标志物。D： 二甲基亚砜，T:TCDD。显示的结果代表了三个独立的实验。
图3
图3。AIP敲除对hepa1c7细胞组分中AHR含量的影响
siRNA被用于击倒Hepa1c7细胞中的AIP。对全细胞裂解物、细胞核、细胞溶质和线粒体部分进行AIP和AHR表达的Western blot分析。α-微管蛋白被用作全细胞裂解物的负荷控制，组蛋白H3（H3）是核组分的负荷控制、乳酸脱氢酶（LDH）是细胞溶质组分的负载控制，细胞色素c氧化酶亚基IV（COX4）是线粒体组分的载量控制。（A）所示结果代表了3个独立实验。第1通道：脂质体治疗（Lipomock），第2通道：10 nM Silencer®Select阴性对照#1 siRNA（siCtrl），第3通道：AIP的10 nM siRNA1（siAIP1），以及AIP的第4通道：10 nM siRNA2（siAIP2）。（B）使用富士图像分析仪测定密度。将AIP和AHR蛋白的表达水平归一化为每个负荷对照。通过与仅受脂质体（Lipomock）影响的细胞的蛋白质表达进行重新规范化，将规范化的蛋白质表达水平相互比较。条形图表示平均值±标准误差（n=3）。
图4
图4。TOMM20敲除对hepa1c7细胞组分中AHR蛋白含量的影响
siRNA被用于击倒Hepa1c7细胞中的TOMM20。对全细胞裂解物、细胞核、细胞溶质和线粒体部分进行TOMM20和AHR表达的Western blot分析。α-微管蛋白被用作全细胞裂解物的负荷控制，组蛋白H3（H3）是核组分的负荷控制、乳酸脱氢酶（LDH）是细胞溶质组分的负载控制，ATP5α是线粒体组分的载荷控制。（A）显示的结果代表了三个独立的实验。泳道1：脂质体胺治疗（Lipomock），泳道2：10nM非靶向siRNA（siCtrl），泳道3：用于TOMM20的10nM siRNA（siTomm20）。（B）和C）用富士图像分析仪测定密度。将TOMM20和AHR蛋白的表达归一化为每个负荷控制。通过与仅受脂质体（Lipomock）影响的细胞的蛋白质表达进行重新规范化，将规范化的蛋白质表达水平相互比较。条形图表示平均值±标准误差（n=3）。
图5
图5。hepa1c7和hepac12细胞耗氧率（OCR）的测量
OCR，计算为（pmole/min/104细胞），在hepa1c7中(A类)和hepac12(C类)对暴露于TCDD（10 nM或30 nM）或载体对照（DMSO 0.01%）的细胞进行基本测量，或在添加（a）寡霉素（0.5μM）、（b）FCCP（1μM用于肝素c7，0.5μM用于肝素c12）和（c）抗霉素a（0.5μM）后进行测量。线表示平均值±标准误差（n=3）。基本呼吸和最大呼吸由制造商的软件计算，XF Mito应激试验报告生成器和呼吸控制率（RCR）由补充表1中提到的hepa1c7方程式计算(B类)和hepac12(D类)单元格。通过方差分析和Tukey的事后检验分析数据的显著差异。星号表示在第页与车辆控制相比，<0.05。
图5
图5。hepa1c7和hepac12细胞耗氧率（OCR）的测量
OCR，计算为（pmole/min/104细胞），在hepa1cc7中(A类)和hepac12(C类)对暴露于TCDD（10 nM或30 nM）或载体对照（DMSO 0.01%）的细胞进行基本测量，或在添加（a）寡霉素（0.5μM）、（b）FCCP（1μM用于肝素c7，0.5μM用于肝素c12）和（c）抗霉素a（0.5μM）后进行测量。线表示平均值±标准误差（n=3）。基本呼吸和最大呼吸由制造商的软件计算，XF Mito应激试验报告生成器和呼吸控制率（RCR）由补充表1中提到的hepa1c7方程式计算(B类)和hepac12(D类)单元格。数据通过方差分析和Tukey的事后检验进行显著差异分析。星号表示在第页与车辆控制相比，<0.05。
图6
图6。TCDD差异表达蛋白的SILAC分析
通过平均值|倍数变化|≥2和Benjamini-Hochberg多重比较校正，对数据进行筛选，以确定差异表达第页≤ 0.05. 比较数据集以通过TCDD暴露鉴定AHR依赖性表达的蛋白质。
图7
图7。二甲基亚砜或TCDD对肝癌1c1c7和c12细胞SILAC鉴定差异表达蛋白的Western blot分析
在暴露于二甲基亚砜（0.01%）或TCDD（10 nM）后，对两种细胞系制备的线粒体部分进行蛋白质印迹。VDAC1用作加载控制。（A）所示结果代表了3个独立实验。（B）使用Bio-Rad ChemiDoc MP系统图像分析仪测定密度。每个蛋白表达均按负荷控制标准化。通过与暴露于二甲基亚砜的hepa1c1c7细胞的蛋白质表达进行重新规范化，将规范化的蛋白质表达水平相互比较。条形图表示平均值±标准误差（n=3）。
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