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.2016年5月；22（5）:547-56。
doi:10.1038/nm.4087。 Epub 2016年4月18日。

人诱导的多能干细胞源性心肌细胞再现了乳腺癌患者对阿霉素诱导的心脏毒性的偏好

保罗·W·伯里奇 1 2 三 4 5, 李永福加 6 7, 埃琳娜·马萨 1 2 三, 吴浩迪 1 2 三, 桑庆翁 1 2 三, 艾伦·沙玛 1 2 三, 亚历山大·霍姆斯特罗姆 1 2 三, 亚历克斯·C·张 1 2 8, 迈克尔·J·科罗拉多 9, 安捷·德·艾伯特 1 2 三, 约书亚·W·诺尔斯 1 三, 梅琳达·L·特利 10, 罗纳德·M·威特莱斯 1 三, 海伦·M·布鲁 1 2 8, 丹尼尔·伯恩斯坦 1 9, 俄罗斯B奥特曼 7 11, Joseph C Wu先生 1 2 三
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人诱导多能干细胞来源的心肌细胞再现了乳腺癌患者对阿霉素诱导的心脏毒性的偏好

保罗·W·伯里奇等。 自然·医学. 2016年5月.

摘要

阿霉素是一种蒽环类化疗药物，可有效治疗多种恶性肿瘤，但它会引起剂量相关的心脏毒性，可能导致部分患者出现心力衰竭。目前，无法预测哪些患者会受到阿霉素诱导的心脏毒性（DIC）的影响。在这里，我们证明了患者特异性人诱导多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CM）可以在细胞水平上重现单个患者对DIC的偏好。来自患有DIC的乳腺癌患者的hiPSC-CM对阿霉素毒性的敏感性始终高于来自未患有DIC患者的hiPSC-CM，这些患者的细胞活力降低，线粒体和代谢功能受损，钙处理受损，抗氧化途径活性降低，活性氧生成增加。综上所述，我们的数据表明，hiPSC-CM是鉴定和表征DIC遗传基础和分子机制的合适平台。

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数字

图1
图1
评估在体外阿霉素诱导的患者特异性hiPSC CMs的心脏毒性。(一)对α-肌动蛋白（ACTN2）和心肌肌钙蛋白T（TNNT2）进行免疫荧光染色，以证明来自未经历阿霉素诱导的心脏毒性（DOX）患者的hiPSC–CMs中的肌聚体组织，与那些在阿霉素治疗24小时后经历过阿霉素诱导心毒性（DOXTOX）的患者相比。比例尺，20µm。(b条)典型的摄像-捕获收缩试验表明，阿霉素治疗24小时后，心跳频率随着阿霉素的变化而变化（图中显示了来自DOX1和DOXTOX4的hiPSC–CMs）。(c（c）)摄像-捕获收缩试验表明，服用阿霉素24小时后，Heathy、DOX和DOXTOX hiPSC–CMs对阿霉素反应的相对峰值变化。每个数据点代表四条重复三次的hiPSC–CM线(n个= 12). (d日)阿霉素（72小时）对hiPSC–CM存活率的影响(n个= 12). 劳埃德50：健康，1.82µM；DOX，3.015µM；DOXTOX，0.1643µM。（e） 阿霉素治疗72小时后hiPSC–CMs早期和晚期凋亡的检测(n个= 4). 未配对双尾t吨–使用测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.005，n.s.=不显著。(（f）)阿霉素（72小时）对caspase 3和7表达的影响(n个= 8). 误差条表示平均值的标准误差（s.e.m.）
图2
图2
评估阿霉素对患者特异性hiPSC-CM的DNA损伤、钙处理和全细胞氧化应激的影响。(一)24小时后使用γ-H2AX免疫荧光染色检测DNA双链断裂。比例尺，20µm。(b条)流式细胞术定量γ-H2AX染色(n个= 4). (c（c）)患者衍生的hiPSC–CMs在基线检查时或使用阿霉素治疗时的自发钙活性的代表性记录，如DOXTOX1所示。(d日)钙成像的归一化相对衰减τ。每个数据点代表四条hiPSC–CM线的平均值(n个>每系35个细胞）。各组被归一化为0µM健康组。通过Fisher精确检验、单因素方差分析检验以及全配对多重比较程序（Holm–Sidak方法）进行比较。(e（电子）)使用CellROX评估24小时阿霉素治疗（细胞死亡前）对全细胞活性氧（ROS）水平的影响。未配对双尾t吨–使用测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.005，n.s.=不显著。误差条代表标准误差。
图3
图3
评估阿霉素对患者特异性hiPSC–CMs氧化应激的影响。(一)24小时阿霉素治疗对过氧化氢（h2O（运行）2)级别。(b条)评估24小时阿霉素治疗对抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）水平的影响。(c（c）)评估24小时阿霉素治疗对线粒体超氧化物（而非其他活性氧或氮物种）水平的影响。(d日)评估24小时阿霉素治疗对线粒体膜电位的影响。(e（电子）)基于ATP的细胞活力测定，证明在铁螯合剂右唑烷（DRZ）存在下，阿霉素72小时治疗的效果。(（f）)基于ATP的细胞活性测定，证明在抗氧化剂存在下阿霉素72小时治疗的效果N个–乙酰-L-半胱氨酸（NAC）对阿霉素的反应。未配对双尾t吨–使用测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.005，n.s.=不显著。误差条代表标准误差。
图4
图4
阿霉素对hiPSC–CMs基因表达的调节。(一)阿霉素治疗心肌细胞后转录反应的功能基因模块。说明将基因表达数据（显示51个变化最大的基因）的ICA分解为多个统计独立的基因模块的线性组合。(b条)前三个基因模块与阿霉素剂量显著相关。模块1，氧化和缺氧应激反应以及与心脏形态发生相关基因的富集。模块2，炎症和DNA损伤修复。模块3，细胞周期阻滞和凋亡。(c（c）)用1µM阿霉素治疗24小时后，DOX和DOXTOX hiPSC株系的差异基因表达归一化为基线表达（共12个样本）。(d日)阿霉素治疗后，DOX和DOXTOX hiPSC–CMs之间的顶级基因热图显著差异表达。(e（电子）)DOX和DOXTOX与1µM阿霉素结果和基因表达模块之间的关系，表明模块2和模块3之间具有很强的相关性。(（f）)1µM阿霉素下DOXTOX与DOX患者差异的散点图(年–轴）与0µM阿霉素的差异(x个–axis）用于选定的生物过程、途径和转录因子。与对角线（虚线）的系统偏差表明患者对阿霉素治疗有特异性反应。给定基因集（如生物过程、通路或TF靶基因集）的重要性通过两种方式进行评估，即平均差异表达和极端差异表达。对于平均差异表达（DE），我们使用t检验来测试δ-δ-表达（y–x）对基因集成员基因与其他基因是否具有相同的平均值。对于极端差异表达，我们使用Fisher精确检验测试基因集成员基因的极端δ-δ-表达值是否丰富。重要：多次测试修正P（P）–值<0.05。
图5
图5
评估患者特异性hiPSC–CMs的基线线粒体功能。(一)暴露于阿霉素后，DOX和DOXTOX hiPSC–CMs中ROS和钙超载相关基因的表达存在差异。(b条)肌聚蛋白、凋亡标记、TOP2B相关蛋白的表达PGC1–α和PGC1–β，静态、和BRCA公司接触阿霉素后，DOX和DOXTOX hiPSC–CMs中的相关基因差异表达。无阿霉素与阿霉素对比，双向方差分析。DOX与DOXTOX，t–测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.005, ****P（P）<0.001，n.s.=不显著。误差条代表标准误差(c（c）)代表性海马细胞外流量测定法，测量耗氧率（OCR）。(d日)Seahorse细胞外通量分析表明，与DOX hiPSC–CMs相比，DOXTOX hiPSC-CMs基线时的耗氧量较低（即无阿霉素治疗）(n个= 12). (e（电子）)10万hiPSC–CMs中ATP水平的量化(n个=8 hiPSC–CM样本）。(（f）)对参与氧化磷酸化的选定蛋白质进行Western blotting，并对Western blot数据的平均相对密度进行量化。(克)柠檬酸合成酶分析用于测量500万iPSC-CM中完整线粒体的基线存在(n个=8，每个数据点是四个细胞系的平均值，有两个实验重复）。(小时)线粒体编码复合物I的定量ND1号机组DNA与核编码复合物II的比例SDHA公司健康对照患者、DOX和DOXTOX hiPSC–CMs的DNA(n个= 4). (我)ND1号机组:SDHA公司DOX和DOXTOX患者成纤维细胞和健康（非阿霉素治疗）患者成纤维纤维细胞的表达比率(n个= 4). (j个)平均ND1:SDHA四种健康、四种DOX和四种DOXTOX hiPSC株系的表达率(n个= 3). 配对双尾t检验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.005，n.s.=不显著。误差条代表标准误差。
图6
图6
与既定DIC途径相关的发现示意图。编号的青色方框显示了我们的发现。阿霉素（DOX）、阿霉素-半醌（DOX-semiquinone）、多柔比星-半醌（DOX-semiquenone），C7中心自由基苷元（C7自由基），一氧化氮合酶3（NOS3），NADH脱氢酶（统称NAD（P）H氧化还原酶），P450（细胞色素）氧化还原酶酶（POR），黄嘌呤氧化酶（XDH）超氧化物自由基（O2–•）、过氧化氢（H2O（运行）2)、羟基自由基（OH•）、一氧化氮（NO•）、过氧亚硝酸盐（ONOO-）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化谷胱甘苷（GSSG）、过氧化物酶原（PRDX）、肌红蛋白（MB）、亚铁（Fe）2+)，铁（Fe3+)，右唑烷（DRZ），N个–乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、拓扑异构酶（DNA）1线粒体（TOP1MT）、BCL2-相关X蛋白（BAX）、细胞色素C（CYCS）肿瘤蛋白p53（TP53）、拓朴异构酶2B（TOP2B）、ryanodine受体2（RYR2）、ATP酶、Ca2+转运、心肌慢收缩2（ATP2A2）、肌球蛋白轻链（MYL）、心肌肌钙蛋白T（TNNT）、α-肌动蛋白（ACTA）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、辅激活剂1–α（PPARGC1A）和过氧化物酶增殖物激活的受体γ、辅助激活剂1-β（PPARCC1B）
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