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.2016年4月14日;11(4):e0148500。
doi:10.1371/journal.pone.0148500。 2016年eCollection。

慢性淋巴细胞白血病中的新生物标记蛋白:对诊断、预后和治疗的影响

附属公司

慢性淋巴细胞白血病中的新生物标记蛋白:对诊断、预后和治疗的影响

Lee Admoni伊莱沙等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

在许多癌症中,细胞经历新陈代谢、细胞生存和抗凋亡防御策略的重新编程,介导这种重新编程的蛋白质代表潜在的生物标记物。在这里,我们通过使用特异性抗体比较慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者和健康献血者外周血单个核细胞的蛋白表达谱,寻找在慢性淋巴细胞白血病中影响诊断、治疗和预后的新生物标记蛋白,质谱和二元logistic回归分析以及其他生物信息学工具。质谱(LC-HR-MS/MS)分析确定了1360个蛋白,其在CLL衍生淋巴细胞中的表达水平发生了改变。其中一些蛋白以前与包括CLL在内的不同癌症类型相关,而另外四种高表达蛋白以前没有报道与癌症相关,这里,DDX46和AK3首次与CLL相关。其中两种蛋白的下调表达导致细胞生长抑制。DDX46高表达水平与CLL患者生存期缩短相关,因此可以作为预后标志物。修饰表达的蛋白质包括参与RNA剪接和翻译的蛋白质,特别是参与凋亡和代谢的线粒体蛋白质。因此,我们重点研究了几种代谢和凋亡调节蛋白,尤其是电压依赖性阴离子通道1(VDAC1),它们同时调节代谢和凋亡。CLL衍生淋巴细胞中Bcl-2、VDAC1、MAVS、AIF和SMAC/Diablo的表达水平显著增加。VDAC1水平与CLL癌CD19+/CD5+细胞的数量以及所测试的所有其他凋亡调节蛋白的水平高度相关。二元logistic回归分析证明了预测疾病概率的能力,准确率超过90%。最后,根据LC-HR-MS/MS显示的CLL患者中几种蛋白质水平的变化,我们可以区分处于稳定疾病状态的患者和那些后来转移到抗癌治疗的患者。因此,过度表达的蛋白可以作为潜在的生物标志物,用于早期诊断、预后、CLL治疗的新靶点和CLL的治疗指导,为个性化治疗奠定基础。

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利益冲突声明

竞争利益:提交人声明,不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。从健康对照和慢性淋巴细胞白血病患者获得的PBMC中蛋白质表达的层次聚类和功能分析。
如材料和方法所述,采用LC-HR-MS/MS分析从健康供体和CLL患者获得的PBMC的蛋白表达谱。答:。提出了基于所有2441个检测到的蛋白的表达模式和至少1个独特肽的层次聚类方法。显示健康(白色)和CLL(灰色)。标准化表达式值的色标显示在右侧。B。本文介绍了与CLL中差异表达蛋白相关的显著富集途径及其富集p值。图表中显示了与每条通路相关的蛋白质数量。C类给出了基于DAVID功能分析的显著富集的官能团,它们的富集p值。图表中显示了与每个功能组相关的蛋白质数量。左边的小馅饼表示凋亡和代谢相关蛋白。
图2
图2。AK3或DDX46表达的siRNA沉默抑制细胞生长。
(A类)健康人和CLL患者之间4种以前未与任何癌症相关的蛋白质的差异表达。(B-D公司)用(50 nM)打乱的siRNA(si-Scr)转染MEC-1细胞,这是两种不同的抗AK3的siRNA之一(siAK3 1或2),或抗DDX46的siRNA中的一种(si-DDX46 1或2(B、 C类)或使用SRB方法分析细胞生长(n=3)(D类).
图3
图3。CLL患者PBMC中Bcl-2、VDAC、AIF、MAVS、SMAC/Diablo和PPWD1的过度表达。
用VDAC1抗体检测CLL患者(P)和健康献血者(H)PBMC细胞裂解物的免疫印迹分析[A,n=28(P),20(H)],Bcl-2[Ab,n=28(P),20(H)],MAVS[Ac(c),n=28(P),19(H)],SMAC/Diablo[Ad日,n=21(P),15(H)],AIF[Ae,n=17(P)、16(H)】,HK-I[A(f),n=28(P),20(H)],BAX[A,n=6(P),6(H)],PPWD1[A小时,n=16(P),10(H)]或β-肌动蛋白。代表性免疫印迹(A类)和定量分析(平均值±SEM)(B类)给出了这些样本和其他样本中健康献血者(白人)和慢性淋巴细胞白血病患者(灰色)的蛋白质水平。对每个样本进行三次独立的免疫印迹。根据Mann-Whitney检验,当P<0.001(***)或P<0.01(**)时,健康组和CLL组之间的差异被认为具有统计学意义。
图4
图4。CLL患者和健康人源性PBMC中凋亡相关蛋白的比较。
散点图显示VDAC1的表达水平(A类)、MAVS(B类),Bcl-2(C类)、SMAC/Diablo(D类)、AIF(E类),HK-I(F类)和Bax(G公司)如图2所示,针对每个对照受试者和CLL患者。使用GraphPad Prism软件计算统计数据。水平线表示每组的平均值。根据Mann-Whitney检验,当P<0.001(***)或P<0.01(**)时,健康供者和CLL患者组之间的差异被认为具有统计学意义。
图5
图5。VDAC1表达水平与癌细胞CD19+/CD5+和凋亡相关蛋白的水平相关。
从代表性健康供体分离的PBMC中CD19+/CD5+细胞的百分比(n=9)(A类)或慢性淋巴细胞白血病患者(n=16)(B类)通过流式细胞术分析,使用针对CD19/CD5的单克隆抗体进行测定。CD19+/CD5+细胞代表癌性CLL B淋巴细胞。使用材料和方法中描述的基于磁珠的方法对3例CLL患者(P)的PBMC进行CD19-阳性细胞分离。使用抗VDAC1抗体的免疫印迹法分析PBMC及其CD19-正和负组分中的VDAC1水平(C类). 定量分析(平均值±SEM)(D)显示了。VDAC1型(E类,右2=0.7)和SMAC/Diablo(F、R2=0.66)表达水平是每个健康供体(O)和CLL患者CD19+/CD5+细胞百分比的函数(▲). VDAC1水平按照图3图例所述进行分析。
图6
图6。基于凋亡相关蛋白相对表达的特异性、敏感性和整体CLL预测的二元logistic回归测试。
以图3中凋亡相关蛋白的相对表达为自变量进行双方差分析。通过使用二元逻辑回归分析,基于0.5的临界值评估凋亡调节蛋白的水平,从敏感性和特异性方面分析数据。健康供体的患病概率(●) VDAC1(A)、SMAC/Diablo(C)、Bcl-2(E)和MAVS(G)的CLL患者(O)。健康献血者的受抚养人被确定为零,慢性淋巴细胞白血病患者的受抚养人为100。采用95%置信区间进行二元logistic回归模型。数据还使用来自CLL患者和健康供体PBMC样本中VDAC1(B)、SMAC/Diablo(D)、Bcl-2(F)和MAVS(H)表达水平的ROC曲线进行分析。用于分类CLL的ROC曲线的AUC显示在每条曲线中。
图7
图7。处于稳定疾病状态的慢性淋巴细胞白血病患者与转移到抗癌治疗的患者之间差异表达的蛋白质。
答:。火山图显示了处于稳定疾病状态的CLL患者(A组)和接受抗癌治疗的患者(B组)之间的蛋白质表达比较。显示了B组和A组之间的p值和表达值差异的大小(折叠变化)。红线表示标称p值截止值为0.01,折叠变化截止值为|2|。19个蛋白质通过了p值<0.01和FC的临界值|2|.B。A组和B组之间差异表达的蛋白质(p值<0.01,FC|2|),分为与癌症相关(灰色)或不相关(白色)的蛋白质。C、。代表性免疫印迹显示A组和B组患者中DHRS4、UBE3A和SLC25A1的表达水平。测定蛋白质水平并将其归一化为β-肌动蛋白。各组的折叠变化以相对单位(RU)表示。

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引用人

工具书类

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出版物类型

赠款和资金

这项工作得到了白血病与淋巴瘤协会(LLS TRP grant#6336-11)的资助。