Glutamine Modulates Macrophage Lipotoxicity

doi:10.3390/nu8040215

.2016年4月12日；8（4）:215。

doi:10.3390/nu8040215。

谷氨酰胺调节巨噬细胞脂质毒性

李贺^1 2, 卡斯桑德拉·韦伯^三 4, 乔尔·德·席林^5 6 7

附属公司

¹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院糖尿病心血管疾病中心，邮编63110。Lhe@dom.wustl.edu。
²美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系，邮编63110。Lhe@dom.wustl.edu。
^三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院糖尿病心血管疾病中心，邮编63110。kweber@wayne.med.edu。
⁴美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系，邮编63110。kweber@wayne.med.edu。
⁵美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院糖尿病心血管疾病中心，邮编63110。schillij@wustl.edu。
⁶美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系，邮编63110。schillij@wustl.edu。
⁷美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系，邮编63110。schillij@wustl.edu。

PMID： 27077881
预防性维修识别码：项目经理4848684
内政部： 10.3390/nu8040215

谷氨酰胺调节巨噬细胞脂质毒性

李赫等。营养物. 2016.

.2016年4月12日；8(4):215.

doi:10.3390/nu8040215。

作者

李贺^1 2, 卡斯桑德拉·韦伯^三 4, 乔尔·德·席林^5 6 7

附属公司

¹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院糖尿病心血管疾病中心，邮编63110。Lhe@dom.wustl.edu。
²美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系，邮编63110。Lhe@dom.wustl.edu。
^三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院糖尿病心血管疾病中心，邮编63110。kweber@wayne.med.edu。
⁴华盛顿大学医学院医学系，美国密苏里州圣路易斯63110。kweber@wayne.med.edu。
⁵美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院糖尿病心血管疾病中心，邮编63110。schillij@wustl.edu。
⁶美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系，邮编63110。schillij@wustl.edu。
⁷美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系，邮编63110。schillij@wustl.edu。

PMID： 27077881
预防性维修识别码：项目经理4848684
内政部： 10.3390/nu8040215

摘要

肥胖和糖尿病与过度炎症和伤口愈合受损有关。越来越多的证据表明巨噬细胞功能障碍是这些炎症缺陷的原因。在营养过剩的情况下，特别是膳食饱和脂肪酸（SFAs），活化的巨噬细胞会产生溶酶体功能障碍，从而触发NLRP3炎性体激活和细胞死亡。将脂质应激与溶酶体病理学联系起来的分子途径尚不清楚，但可能是一个可行的治疗靶点。激活的巨噬细胞对谷氨酰胺的摄取增加，导致我们假设，在脂质过多的情况下，谷氨酰胺代谢会压倒线粒体，促进有毒代谢物的积累。为了研究这个问题，我们使用暴露于SFA棕榈酸酯的LPS激活的腹腔巨噬细胞评估了在缺乏谷氨酰胺的情况下巨噬细胞的脂肪毒性。我们发现，谷氨酰胺缺乏可减少脂质诱导的溶酶体功能障碍、炎症小体激活和细胞死亡。在谷氨酰胺缺乏的情况下，mTOR激活降低，自噬增强；然而，自噬对拯救表型是不可或缺的。相反，谷氨酰胺缺乏阻止了SFA棕榈酸酯对线粒体呼吸的抑制作用，这种表型与防止巨噬细胞死亡有关。总之，这些发现揭示了激活诱导的代谢重编程与营养微环境之间的串扰可以显著改变巨噬细胞对炎症刺激的反应。

关键词：细胞死亡；炎症小体；溶酶体；新陈代谢。

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数字

图1
活化巨噬细胞中谷氨酰胺代谢增加。(A类)腹腔巨噬细胞（pMAC）用对照组（BSA-PBS）、BSA-LPS（100 ng）或棕榈（250µM）-LPS（100ng）处理16 h；用质谱法测定细胞内谷氨酰胺水平；(B)在指示的刺激16小时后，NH₄在上清液中定量释放；(C类)pMAC在谷氨酰胺充足（开放条）或谷氨酰胺缺乏（填充条）培养基和NH中刺激₄在16 h时定量释放到培养基中。柱状图报告至少3次实验的平均值±标准误差（SE），每次实验一式三份。*,第页PBS<0.05与.LPS；#，第页<0.05谷氨酰胺与。不含谷氨酰胺。

图2
谷氨酰胺缺乏可防止巨噬细胞的脂肪毒性。(A类,B)用BSA-PBS或palm-LPS在谷氨酰胺充足（开放条）或谷氨酰胺缺乏（黑条）的培养基中刺激pMAC，并用膜联蛋白-PI评估30小时后的细胞死亡(A类)或通过溶酶体裂解红染色在24小时测定溶酶体损伤(B)均与流式细胞仪联用；(C类,D类)在指示的刺激后，IL-1β(C类)或TNFα(D类)使用ELISA定量上清液中的释放。条形图报告了至少3个实验的平均值±SE，每个实验一式三份。*,第页PBS<0.05与。LPS；#，第页<0.05谷氨酰胺与.不含谷氨酰胺。

图3
α-酮戊二酸能部分恢复谷氨酰胺缺乏条件下巨噬细胞的脂毒性表型。(A类)巨噬细胞在谷氨酰胺充足和不足的培养基中进行处理，培养基为±440 nMα-酮戊二酸（α-KG）和细胞死亡(A类)或溶酶体裂解器低细胞(B)流式细胞术定量；(C类,D类)在谷氨酰胺充足和缺乏的培养基±α-KG和IL-1β中用棕榈LPS刺激pMACs(C类)或TNFα(D类)通过ELISA定量释放。条形图报告了至少3个实验的平均值±SE，每个实验一式三份。*,第页<0.05（对于车辆）与.α-KG；#，第页<0.05谷氨酰胺与.不含谷氨酰胺。

图4
抑制谷氨酰胺水解部分模拟谷氨酰胺缺乏。(A类,B)在谷氨酸解抑制剂BPTES存在下，用BSA-PBS刺激初级巨噬细胞((A类)10µM）或C698((B)10µM）；(C类)在C968的BTPES存在下，用palm-LPS处理的pMAC定量IL-1β释放。条形图报告了至少3个实验的平均值±SE，每个实验一式三份。*,第页<0.05（对于车辆）与.抑制剂。

图5
亮氨酸缺乏不能保护巨噬细胞免受脂肪毒性。巨噬细胞在完整的RPMI培养基（开放条）或缺乏亮氨酸（灰色填充条）或谷氨酰胺（黑色填充条）的RPMI中培养，在指示的刺激后，通过膜联蛋白-PI流式细胞术测定细胞死亡。条形图报告了至少3个实验的平均值±SE，每个实验一式三份。#，第页<0.05谷氨酰胺与.不含谷氨酰胺。

图6
谷氨酰胺缺乏损害mTORC1的激活。(A类)mTORC可以组装成两种不同的复合物，分别称为mTORC1和mTORC2，这两种复合物分别导致S6K和AKT的磷酸化；(B)在存在或不存在谷氨酰胺的情况下，用BSA-PBS、BSA-LPS或palm-LPS刺激pMAC 16 h，并通过Western blotting评估S6K和AKT的磷化作用。总S6K和总AKT显示为对照；(C类)按照指示在谷氨酰胺充足或不足的培养基±α-KG（440 nM）中处理巨噬细胞16 h，并通过Western blotting测定S6K磷酸化。

图7
谷氨酰胺缺乏会调节自噬。(A类)用BSA-PBS或palm-LPS在谷氨酰胺充足或谷氨酰胺缺乏的培养基±α-KG（440 nM）中处理pMAC。将细胞培养16 h，然后培养2 h veh或bafilomycin（BAF；50 nM）。对蛋白裂解产物进行LC3或p62表达分析。Actin显示为加载控件；(B)按照指示，在含有或不含谷氨酰胺的培养基中刺激细胞16小时，然后qRT-PCR评估LC3和p62 mRNA的表达。条形图报告了至少3个实验的平均值±SE，每个实验一式三份。*,第页PBS<0.05与.LPS；#，第页<0.05谷氨酰胺与.不含谷氨酰胺。

图8
自噬对谷氨酰胺缺乏症的保护作用是必不可少的。(A类)从WT（ATG5 flx/flx）或ATG5KO（ATG 5 flx/flx-LysM-Cre）分离出初级巨噬细胞，然后在谷氨酰胺存在或不存在的情况下用BSA-PBS或palm-PLS刺激。通过蛋白质印迹法评估LC3和p62蛋白的表达水平。肌动蛋白显示为蛋白质负荷控制；(B)如图所示，刺激WT和ATG5KO小鼠的pMACs，并使用annexin-PI流式细胞术在30 h测定细胞死亡。条形图报告了至少3个实验的平均值±SE，每个实验一式三份。*，第页<0.05（对于WT）与.ATG5KO型。

图9
谷氨酰胺缺乏改变线粒体代谢。(A类——C类)在谷氨酰胺充足的培养基中，用BSA-PBS（黑色）、BSA-LPS（红色）或棕榈-LPS（蓝色）刺激pMAC 16小时(A类)或谷氨酰胺缺乏培养基±α-KG(B,C类)使用Seahorse流量分析仪评估线粒体代谢。在基线和注射寡霉素后评估线粒体耗氧量（OCR）(**O（运行）**)、催化裂化装置(F类)鱼藤酮/抗霉素（R/A）；(D类,E类)贝斯林OCR(D类)或细胞外酸化率（ECAR(E类))据报道是由刺激细胞产生的(A类——C类). 条形图报告了至少3个实验的平均值±SE，每个实验一式三份。*，第页BSA-PBS<0.05与.BSA-LPS；**，第页<0.05牛血清白蛋白-LPS与.palm-LPS；#，第页<0.05谷氨酰胺与.不含谷氨酰胺。

**图10**
谷氨酰胺充足和不足条件下的巨噬细胞脂肪毒性模型。当谷氨酰胺可用时，TLR4激活刺激谷氨酰胺摄取，mTORC1激活，TCA中间体（如α-KG）的形成增强，线粒体呼吸增加。棕榈酸等过量脂肪酸的存在会抑制线粒体呼吸，在LPS激活的情况下，线粒体呼吸可能会促进有毒代谢物、脂质和/或氧化还原应激的积累。溶酶体功能障碍继而导致巨噬细胞死亡和炎症小体激活。在缺乏谷氨酰胺的情况下，mTORC1激活和线粒体呼吸减少，导致自噬率增加。在这种情况下，棕榈酸酯不再抑制线粒体功能，这可能是通过减少有害代谢物和脂质的形成来防止溶酶体功能障碍。

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