Silencing of hERG1 Gene Inhibits Proliferation and Invasion, and Induces Apoptosis in Human Osteosarcoma Cells by Targeting the NF-κB Pathway

doi:10.7150/jca.13289

.2016年4月10日；7(6):746-57.

doi:10.7150/jca.13289。电子收集2016。

沉默hERG1基因通过靶向NF-κB途径抑制人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭并诱导细胞凋亡

曾文荣¹, 刘庆军¹, 陈志达¹, 吴新余², 袁福忠^三, 金武¹

附属公司

¹1.厦门大学东南附属医院骨科，解放军骨科中心，漳州，363000，中华人民共和国。
²2.厦门大学东南附属医院神经内科，漳州，363000，中华人民共和国。
^三3.厦门大学东南附属医院中心实验室，漳州，363000，中华人民共和国。

PMID： 27076857
预防性维修识别码： PMC4829562
内政部： 10.7150/jca.13289

沉默hERG1基因通过靶向NF-κB途径抑制人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭并诱导细胞凋亡

曾文荣等。 J癌症. 2016.

.2016年4月10日；7(6):746-57.

doi:10.7150/jca.13289。电子收集2016。

作者

曾文荣¹, 刘庆军¹, 陈志达¹, 吴新余², 袁福忠^三, 金武¹

附属公司

¹1.厦门大学附属东南医院骨科，中国人民解放军骨科中心，漳州，363000。
²2.厦门大学东南附属医院神经内科，漳州，363000，中华人民共和国。
^三3.厦门大学东南附属医院中心实验室，漳州，363000，中华人民共和国。

PMID： 27076857
预防性维修识别码： PMC4829562
内政部： 10.7150日元/日元13289日元

摘要

最近，电压依赖性钾通道（Kv）家族成员人类乙醚go-go（eag）相关基因1（hERG1）通道被确定在癌细胞增殖、侵袭、肿瘤发生和凋亡中起关键作用。然而，骨肉瘤细胞中hERG1的表达水平和功能尚不明确。在本研究中，使用半定量实时PCR（RT-PCR）、Western blot和免疫组织化学方法测量骨肉瘤细胞和组织中hERG1转录和蛋白水平。采用CCK-8、集落形成、流式细胞术、caspase-3活性、伤口愈合和基于transwell的分析，检测hERG1基因敲除对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。此外，采用半定量RT-PCR、Western blot和荧光素酶报告分析评估hERG1抑制对核因子-κB（NF-κB）通路的影响。此外，还研究了NF-κB p65-siRNA和NF-κ）B p65表达对骨肉瘤细胞存活的影响。通过这项工作，确定了hERG1与NF-κB通路的关系。发现骨肉瘤细胞和组织表达高水平的hERG1。敲除hERG1显著抑制细胞增殖和侵袭，并诱导凋亡，而抑制hERG2显著降低NF-κB的活化。总之，hERG1可能刺激p65的核转位，从而通过激活hERG1/β1整合素复合物和PI3K/AKT信号调节NF-κB途径。综上所述，这些结果表明hERG1对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的调节是必要的。此外，hERG1的这种调节至少部分通过NF-κB途径的介导。

关键词：细胞凋亡；细胞增殖；人乙醚-go-go相关基因1；入侵；核因子-κB。；骨肉瘤。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者声明他们没有竞争利益。

数字

图1
**骨肉瘤细胞和组织中hERG1的高表达。**（A）采用半定量RT-PCR检测SH-SY5Y、MG-63和HEK293细胞中hERG1 mRNA水平。β-actin作为内标。（B） Western blot检测SH-SY5Y、MG-63和HEK293细胞中hERG1的蛋白表达。采用GAPDH作为内标。（C） MG-63细胞hERG1的免疫组织化学染色。使用配备CCD彩色相机的奥林巴斯光学显微镜拍摄图像。（D）人脑（作为阳性对照）、骨肉瘤和骨纤维异常增生样本中hERG1的免疫组织化学P<0.001。

图2
**敲除hERG1可减少骨肉瘤细胞的增殖。**（A） Western blot检测hERG1-siRNA的敲除效率。（B-E）使用CCK-8或集落形成试验（n=6）测量转染hERG1-siRNA（30 nM）（B和C）或用hERG1抑制剂E-4031（D）或激活剂PD 118057（E）处理的MG-63细胞的增殖。（F） Western blot检测HEK293-wt和HEK293-hERG1细胞中hERG2的蛋白表达。（G） 1×10⁵培养HEK293-wt和HEK293-hERG1细胞48小时，并进行CCK-8分析。（H）通过CCK-8分析测定E-4031对HEK293-wt和HEK293-hERG1细胞增殖的影响。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图3
**hERG1基因敲除对骨肉瘤细胞凋亡的影响。**（A）将hERG1-siRNA转染MG-63细胞，然后进行流式细胞术分析。未经处理或转染对照siRNA的细胞作为对照。右下象限的细胞为膜联阳性，为早期凋亡细胞（n=3）。（B） Western blot检测Caspase-3和PARP的裂解。（C）与对照组和未经处理的细胞相比，转染hERG1-siRNA的细胞caspase-3活性显著增加。**P<0.01，***P<0.001。

图4
**敲除hERG1抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。**（A）在经过不同处理的MG-63细胞的融合粘附层上划痕。24小时后，对迁移至伤口的细胞进行计数（n=3）。展示了伤口的代表性图片。（B）用所示的siRNAs转染MG-63细胞，并通过transwell分析评估细胞的侵袭能力（n=3）。**P<0.01。

图5
**NF-κB通路参与hERG1调节骨肉瘤细胞存活。**（A和B）抑制hERG1对NF-κB通路相关基因表达的影响。MG-63细胞转染hERG1-siRNA或对照siRNA，或不处理，并通过半定量RT-PCR和Western blot分析所示的mRNA和蛋白质。（C）抑制hERG1对NF-κB介导转录的影响。（D） NF-κB p65在转染pcDNA3.1-hERG1或pcDNA3.1的MG-63细胞中的核定位。（E和F）在用NF-κB p65 siRNA或pCDNA3.1 NF-κB p65瞬时转染的MG-63细胞中进行CCK-8测定。（G） hERG1敲除对Akt磷酸化的影响。（H）测定NF-κB p65的核定位（上面板）和相对细胞增殖率（下面板）。（一）用LY264002处理的MG-63细胞中NF-κB p65的核定位P<0.05，**P<0.01。

图5
**NF-κB通路参与hERG1调节骨肉瘤细胞存活。**（A和B）抑制hERG1对NF-κB通路相关基因表达的影响。MG-63细胞转染hERG1-siRNA或对照siRNA，或不处理，并通过半定量RT-PCR和Western blot分析所示的mRNA和蛋白质。（C） hERG1抑制对NF-κB介导的转录的影响。（D） NF-κB p65在转染pcDNA3.1-hERG1或pcDNA3.1的MG-63细胞中的核定位。对瞬时转染NF-κB p65-siRNA或pCDNA3.1 NF-κ）B p65的MG-63细胞进行（E和F）CCK-8分析。（G） hERG1敲除对Akt磷酸化的影响。（H）测定NF-κB p65的核定位（上面板）和相对细胞增殖率（下面板）。（一）用LY264002处理的MG-63细胞中NF-κB p65的核定位P<0.05，**P<0.01。

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