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.2016年4月6日；17(4):515.
doi:10.3390/ijms17040515。

自噬性细胞死亡和凋亡联合介导苯磺酸环磷酰胺诱导的细胞损伤

海霞庄 1, 田伟力 2, 文丽（Wen Li） 三, 张兴利 4, 王晶晶（音译） 5, 岳阳 6, 刘欣 7, 郑元霞 8, 杜峰 9 10, 张良庆 11
附属公司

自噬性细胞死亡和凋亡联合介导苯磺酸环磷酰胺诱导的细胞损伤

海霞庄等。 国际分子科学杂志. .

摘要

苯磺酸环沙曲库铵是一种理想的非去极化肌松药，临床应用广泛。然而，一些研究表明苯磺酸顺阿曲库铵可以影响细胞增殖。此外，其具体行动机制尚不清楚。在这里，我们发现在药物治疗的GFP-LC3和MitoDsRed稳定的HeLa细胞中，GFP-LC2（绿色荧光蛋白轻链3）阳性自噬体的数量和线粒体断裂的速率都显著增加。此外，顺阿曲库铵促进LC3和线粒体的共定位并诱导自溶体的形成。线粒体蛋白水平下降，而溶酶体抑制剂Bafinomycin A1逆转了这种情况。在HeLa和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中也发现了类似的结果和剂量依赖性效应的证据。Cisatracurium在100µM时将HUVEC存活率降低至0.16（OD490），在体外48小时后降低至0.05（OD490；它以浓度和时间依赖性的方式将100µM时的细胞死亡率增加到56%，24小时后增加到60%（p<0.01）。在Atg5 WT（野生型）MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）中，细胞增殖显著降低四倍（p<0.01），但在Atg5KO（敲除）MEF中，即使使用高剂量顺阿曲库铵治疗，细胞增殖也不受影响。即使在存在凋亡抑制剂zVAD的情况下，顺阿曲库铵也能诱导野生型MEFs的细胞死亡显著增加。因此，我们得出结论，自噬细胞死亡和细胞凋亡途径的激活都有助于顺阿曲库铵介导的细胞损伤。

关键词：细胞凋亡；自噬体；顺阿曲库铵；线粒体。

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数字

图1
图1
Cisatracurium在哺乳动物细胞中以剂量和时间依赖性的方式触发过度线粒体自噬。(A类)GFP-LC3和MitoDsred双荧光稳定细胞系与顺阿曲库铵（0、2.5、5、10、25、50或100µM）孵育12小时。MitoDsred（红色）表示线粒体。箭头表示LC3阳性自噬体样结构与线粒体的共定位。白色斑点框表示细胞的放大部分。棒材=30µm；(B)在存在或不存在溶酶体抑制剂Bafinomycin A1（50 nM，B1793）的情况下，用顺阿曲库铵（5µM）培养GFP-LC3和MitoDsred双荧光稳定细胞0、6、12或24小时。箭头表示LC3阳性自噬体样结构与线粒体共定位。Bar=30µm。箭头表示LC3阳性囊泡与线粒体共定位；(C类)希拉牌手表(上面的面板）或HUVEC(降低面板）与顺阿曲库铵（0、2.5、5、10、25或50µM）孵育12 h。然后使用LC3、TIM23、TOM20、VDAC或β-肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。数据以三个独立实验的代表性图像表示，指示条带的强度用ImageJ软件测量并用Beta-actin归一化；(D类)希拉牌手表(上面的面板）或HUVEC(降低在存在或不存在溶酶体抑制剂Bafinomycin A1（50 nM，B1793）的情况下，用顺阿曲库铵（5µM）孵育0、6、12或24小时。然后使用LC3、TIM23、TOM20、VDAC或β-肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。数据以三个独立实验的代表性图像表示，指示带的强度用ImageJ软件测量并用Beta-actin归一化。
图1
图1
Cisatracurium在哺乳动物细胞中以剂量和时间依赖性的方式触发过度线粒体自噬。(A类)将GFP-LC3和MitoDsred双荧光稳定细胞系与顺阿曲库铵（0、2.5、5、10、25、50或100µM）孵育12小时。GFP-LC3（绿色）点显示自噬体样结构。MitoDsred（红色）表示线粒体。箭头表示LC3阳性自噬体样结构与线粒体的共定位。白色斑点框表示细胞的放大部分。棒材=30µm；(B)在存在或不存在溶酶体抑制剂Bafinomycin A1（50 nM，B1793）的情况下，用顺阿曲库铵（5µM）培养GFP-LC3和MitoDsred双荧光稳定细胞0、6、12或24小时。箭头表示LC3阳性自噬体样结构与线粒体共定位。Bar=30µm。箭头表示LC3阳性囊泡与线粒体共定位；(C类)希拉牌手表(上面的面板）或HUVEC(降低面板）与顺阿曲库铵（0、2.5、5、10、25或50µM）孵育12 h。然后使用LC3、TIM23、TOM20、VDAC或β-肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。数据以三个独立实验的代表性图像表示，指示条带的强度用ImageJ软件测量并用Beta-actin归一化；(D类)希拉牌手表(上面的面板）或HUVEC(降低在存在或不存在溶酶体抑制剂Bafinomycin A1（50 nM，B1793）的情况下，用顺阿曲库铵（5µM）孵育0、6、12或24小时。然后使用LC3、TIM23、TOM20、VDAC或β-肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。数据以三个独立实验的代表性图像表示，指示带的强度用ImageJ软件测量并用Beta-actin归一化。
图2
图2
苯磺酸环磷酰胺诱导自溶体形成。HUVEC与顺阿曲库铵（0、5、25或100µM）孵育12 h。通过电子显微镜分析样品。红色箭头表示自溶体。自溶体的数量以浓度依赖的方式增加。
图3
图3
Cisatracurium可抑制细胞增殖并诱导细胞死亡。(A类)HUVEC与顺阿曲库铵（0、5、10、25、50或125µM）孵育12 h。通过CCK分析分析细胞活力；(B)HUVEC与顺阿曲库铵（10µM）孵育0、6、12、24或45小时。通过CCK分析分析细胞活力；(C类)将HUVEC与顺阿曲库铵（0、5、10、25、50或100µM）孵育12小时。通过PI和膜联蛋白-5对细胞进行染色，然后通过流式细胞术分析以计算细胞凋亡率。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。第页<0.01；(D类)HUVEC与顺阿曲库铵（5µM）孵育0、6、12或24小时。细胞用PI和Annexin-5染色，然后用流式细胞仪分析以计算凋亡率。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。第页<0.01；(E类)HUVEC与顺阿曲库铵（0、10、25、50、100µM）孵育12 h。然后使用抗PARP或β-肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。数字表示裂解PARP与β-肌动蛋白的归一化光密度比。数据显示为三个独立实验的代表性图像。
图4
图4
在ATG5缺乏的细胞中，顺阿曲库铵抑制细胞增殖和诱导细胞死亡被阻断。(A类)WT或ATG5 KO MEF与顺阿曲库铵（0、10、25、50或125µM）孵育12 h。通过CCK分析分析细胞活力；(B)将WT或ATG5 KO MEFs与顺阿曲库铵（0、25、50、75或100µM）孵育12小时。通过光学显微镜观察细胞。棒材=100µm；(C类)将WT或ATG5 KO MEF与顺阿曲库铵（5µM）在Baf A1存在或不存在的情况下孵育0、6、12或24小时。细胞经抗LC3（绿色）和抗TOM20（红色）抗体染色。棒材=15µm；(D类)将WT或ATG5 KO MEF与顺阿曲库铵（5µM）在Baf A1存在或不存在的情况下孵育0、6、12或24小时。然后使用LC3、Tim23、TOM20、ATG5或β-肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。数字表示指示带与β-肌动蛋白的归一化光密度比。数据以三个独立实验的代表性图像呈现，指示带的强度用ImageJ软件测量并用Beta-actin归一化。
图4
图4
顺式阿曲库铵对细胞增殖的抑制和对细胞死亡的诱导在ATG5缺陷细胞中被阻断。(A类)WT或ATG5 KO MEF与顺阿曲库铵（0、10、25、50或125µM）孵育12 h。通过CCK分析分析细胞活力；(B)将WT或ATG5 KO MEF与顺阿曲库铵（0、25、50、75或100µM）孵育12 h。通过光学显微镜观察细胞。棒材=100µm；(C类)将WT或ATG5 KO MEF与顺阿曲库铵（5µM）在Baf A1存在或不存在的情况下孵育0、6、12或24小时。细胞经抗LC3（绿色）和抗TOM20（红色）抗体染色。棒材=15µm；(D类)将WT或ATG5 KO MEF与顺阿曲库铵（5µM）在Baf A1存在或不存在的情况下孵育0、6、12或24小时。然后使用LC3、Tim23、TOM20、ATG5或β-肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。数字表示指示带与β-肌动蛋白的归一化光密度比。数据以三个独立实验的代表性图像呈现，指示带的强度用ImageJ软件测量并用Beta-actin归一化。
图5
图5
Cisatracurium即使在存在凋亡抑制剂zVAD的情况下也能促进细胞死亡。(A类)在存在或不存在凋亡抑制剂Z-VAD（50µM）的情况下，将WT MEF与顺阿曲库铵（0、25、50、75、100或125μM）孵育12 h。CCK8法检测细胞活力；(B)在存在或不存在凋亡抑制剂Z-VAD的情况下，将WT MEFs与顺阿曲库铵（0、25、50、75或100µM）孵育12小时。光镜下观察细胞。棒材=100µm；(C类)在Baf A1存在或不存在的情况下，用顺阿曲库铵（10µM）培养WT MEF 0、6、12或24小时。细胞经抗LC3（绿色）和抗TOM20（红色）抗体染色。棒材=20µm。
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