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.2016年5月17日；35(10):1045-57.
doi:10.15252/embj.201592994。 Epub 2016年4月6日。

线粒体外膜蛋白MDI促进局部蛋白质合成和线粒体DNA复制

张毅（音） 1, 陈勇（音） 2, 马尔扬·古塞克 2, 洪旭 三
附属公司

线粒体外膜蛋白MDI促进局部蛋白质合成和线粒体DNA复制

张毅（音）等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

早期胚胎发育具有快速的核DNA复制周期，但缺乏mtDNA复制。为了满足胚胎发生的高能量需求，成熟卵母细胞提供了大量线粒体和线粒体DNA。然而，在卵巢中驱动大规模线粒体DNA复制的细胞机制尚不清楚。在这里，我们描述了果蝇AKAP蛋白MDI，它将翻译刺激因子La相关蛋白（Larp）引入卵巢线粒体外膜。MDI-Larp复合物通过线粒体表面的细胞溶质核糖体促进核编码线粒体蛋白质子集的合成。MDI-Larp的靶点包括线粒体DNA复制因子、线粒体核糖体蛋白和电子转运链亚单位。缺乏MDI会导致卵巢中线粒体DNA复制减少，从而导致成熟卵子中线粒体DNA缺乏。不依赖MDI将Larp靶向线粒体外膜可恢复局部蛋白质合成并挽救MDI突变苍蝇的表型。我们的研究表明，线粒体外膜上MDI-Larp复合物的选择性翻译促进可能对线粒体DNA复制和卵子发生期间线粒体生物发生至关重要。

关键词：DNA复制；卵子发生；蛋白质合成。

PubMed免责声明

数字

图EV1
图EV1。公吨DNA中的复制多学科发展指数 核糖核酸我和PKA公司变异卵巢

  1. 对照组和对照组卵巢中EdU掺入说明DNA复制多学科发展指数RNAi飞行。箭头指向线粒体，箭头指向细胞核。基因型：UAS‐骰子；个加仑4（控制）；UAS‐骰子；nos‐gal4；UAS‐CG3249 红外[CG3249（mdi）RNAi]。生殖晚期卵巢表达mtDNA复制受到抑制多学科发展指数RNAi。比例尺，10μm。

  2. 线粒体DNA在wt和PKA公司通过EdU合并说明突变克隆。箭头指向mtDNA复制。wt克隆（实心圆）标记有核定位RFP报告器（*）。公共事业管理局缺少RFP信号的空突变克隆（虚线圆圈）显示正常的mtDNA复制（箭头）。比例尺，10μm。

图1
图1。多学科发展指数基因、蛋白质和多学科发展指数 1删除

  1. 的示意图多学科发展指数基因组位点显示CG3249号(多学科发展指数)转录本（灰盒）和编码区（黑盒），以及由CRISPR/Cas9介导的重组与两个导向RNA产生的gfp插入的位置（箭头）。由此产生的融合蛋白被称为MDI‐GFP。这个mdi公司 1突变是一个2.4kb的缺失，它删除了大多数多学科发展指数编码区域。

  2. 野生型（wt）和多学科发展指数 1苍蝇，证明了这一点多学科发展指数 1是一种蛋白缺失突变。Tubulin被用作负荷控制。

  3. 表达MDI‐GFP的卵巢用线粒体标记物ATP合酶（ATP‐S）染色。重叠信号（合并）表明MDI定位于线粒体。请注意，MDI在生殖细胞晚期（左侧面板）和卵细胞（右侧面板）中高度表达。比例尺，10μm。

图2
图2。MDI公司推广mtDNA卵巢中的复制对女性生育至关重要
  1. A–C

    mtDNA在wt（A）和多学科发展指数 1卵巢（B，C），如EdU合并所示。箭头指向线粒体DNA，箭头指向细胞核。在wt卵巢（A）中，mtDNA复制开始于生殖期2B，并持续到卵室期2（S2）。最多多学科发展指数 1卵巢（B），线粒体DNA复制在这些阶段是无法检测到的，而在一些（C），它似乎延迟到生殖菌阶段3。比例尺，10μm。

  2. D类

    不同突变基因型雌性产卵的孵化率和mtDNA含量与wt对照组产卵的相关。每个数据点代表三个独立重复的平均值。误差条表示SD。的表达式多学科发展指数或哈卡普1在里面多学科发展指数 1显著恢复mtDNA水平和孵化率。N个孵化率=3×>100枚/基因型。相对mtDNA水平测定为三个生物重复序列的平均值。P（P）‐比较值多学科发展指数 1；nos>mdi到多学科发展指数 1：孵化率，P（P）= 1995年1月19日−05; 线粒体DNA，P（P）= 0.0078.P（P）‐比较值多学科发展指数 1；数量>hAKAP1到多学科发展指数 1：孵化率，P（P）= 1.6998东经−05; mtDNA水平，P（P）= 0.0009.

图EV2
图EV2。线粒体聚集在一起多学科发展指数 1卵巢及其卵子

  1. wt和中密度指数 1卵巢ATP‐S染色，显示线粒体形态。请注意，线粒体在中晚期卵泡室中逐渐聚集在一起多学科发展指数 1苍蝇。比例尺，10μm。

  2. 代表性图像wt和多学科发展指数 1卵细胞ATP‐S染色，显示线粒体形态。比例尺，100μm。

  3. wt和多学科发展指数 1鸡蛋被ATP‐S染色。比例尺，20μm。注意卵子中聚集的线粒体由mdi公司 1苍蝇。

数据信息：箭头指向通常与wt和fusome相关的线粒体多学科发展指数 1卵巢。箭头指向中聚集的线粒体多学科发展指数 1卵巢和卵子。
图3
图3。功能遗传分析MDI公司及其与Larp的相互作用

  1. MDI蛋白和缺失突变体示意图。这些蛋白在纳米gal4并测试了他们拯救孵化率和卵子mtDNA水平的能力mdi公司 1雌性（子代柱）或用于将伙伴蛋白Larp定位并招募到培养细胞中的线粒体（定位柱）。N个孵化率=3×>100枚/基因型。相对mtDNA水平是三个生物重复序列的平均值。

  2. 图（A）所示为表达MDI蛋白GFP融合（绿色）的S2细胞的代表性图像。用MitoTracker红（红色）标记线粒体显示重叠信号（黄色），表明除MDI外的所有融合蛋白都正确定位于线粒体∆MTS.

  3. MDI的软骨下定位。表达MDI‐myc融合蛋白的培养细胞的线粒体保持完整或肿胀以破坏其外膜，并用蛋白酶K（PK）消化或不消化。蛋白质提取物进行Western blot分析。Tom20、细胞色素C（cyt.C）和SOD2分别用作外膜、膜间隙和基质的标记物。MDI表现为一种外膜蛋白。

  4. MDI蛋白的Western blots（重量）和多学科发展指数敲除（mdi‐ko）细胞证实mdi‐）ko细胞完全缺乏mdi蛋白。肌动蛋白被用作加载控制。

  5. 表达Larp‐GFP融合蛋白的wt或mdi‐ko细胞的代表性图像，并用MitoTracker Red染色以标记线粒体。大多数Larp定位于wt细胞中的线粒体（红色和绿色重叠信号），但扩散到mdi-ko细胞细胞质中。

  6. 与mdi共表达Larp-GFP的mdi‐ko细胞的代表性图像或（A）中所示的缺失突变体与mCherry融合。定位于线粒体的4个MDI缺失中，2个（MDIΔR和MDIΔ都铎)不允许Larp‐GFP定位于线粒体多学科发展指数 1测定了表达MDI或MDI缺失突变体的苍蝇及其卵孵化率和mtDNA水平。结果总结在（A）中。

数据信息：（B、E、F）中的比例尺，10μm。
图4
图4。MDI公司将拉普招募到线粒体

  1. 转染S2细胞中Larp与MDI‐myc的免疫共沉淀。Tubulin被用作负荷控制。

  2. 线粒体DNA复制，如EdU合并所示，以wt和百灵鸟突变体(警报)卵巢。线粒体DNA复制在百灵鸟卵巢。箭头：mtDNA；箭头：细胞核。

  3. 重量和多学科发展指数 1对卵室进行Larp（绿色）和ATP-S（红色）染色，以显示线粒体。Larp与wt卵室中的线粒体密切相关。线粒体多学科发展指数 1苍蝇聚在一起，完全没有幼虫染色。

数据信息：（B，C）中的比例尺，10μm。
图EV3
图EV3。幼虫在卵巢中的定位及线粒体蛋白在卵巢和体细胞组织中的表达

  1. 野生型和多学科发展指数 1对生殖菌进行Larp（绿色）和ATP-S（红色）染色以显示线粒体。注意，Larp与生殖菌（箭头）中的线粒体密切相关。线粒体多学科发展指数 1苍蝇完全没有Larp染色。比例尺，10μm。

  2. Tom20-LarpGFP（Tom20-Larp）融合蛋白在纳米gal4在中多学科发展指数 1用ATP‐S（红色）染色以标记线粒体的卵室。注意，Tom20‐Larp集中在线粒体（ATP‐S）周围多学科发展指数 1背景。比例尺，10μm。

  3. 野生型苍蝇卵巢和体细胞组织中几种线粒体蛋白质的蛋白质印迹。框中有mtDNA复制因子，包括TFAM、mtDNA聚合酶（Tamas）、线粒体单链DNA结合蛋白（mtSSB）、线粒体RNA聚合酶、MDI和Larp。除TFAM外，mtDNA复制所需的大多数蛋白质在卵巢线粒体中上调。微管蛋白被用作负荷控制。

图EV4
图EV4。HpG掺入法观察卵巢新生蛋白合成

  1. 表达Tom20‐mCherry的卵巢的代表性图像，与蛋氨酸类似物L‐高丙炔甘氨酸（HpG）孵育30分钟，以标记新生蛋白质合成。通过点击化学，用Alexa Fluor 488可视化HpG。Alexa Fluor 488的新生蛋白合成信号对免疫染色分析中使用的洗涤剂清洗很敏感。因此，Tom20‐mCherry被用来标记线粒体。

  2. HpG在存在特异性抑制线粒体核糖体的氯霉素的情况下在卵巢中掺入的代表性图像。氯霉素对中期卵室内HpG掺入没有影响。

  3. 在环己酰亚胺抑制细胞溶质核糖体存在的情况下，HpG并入卵泡膜的代表性图像。注意，环己酰亚胺大大降低了HpG信号。

数据信息：箭头指向与线粒体相关的HpG信号。箭头指向核周区的HpG信号。比例尺in（A–C），10μm。
图5
图5。线粒体表面的蛋白质合成

  1. HpG在wt和多学科发展指数 1蛋室。箭头指向核周区和细胞外围ER上的HpG信号。箭头指向与线粒体相关的HpG信号。线粒体以Tom20‐mCherry（红色）标记，该标记是通过在内源性细胞中插入mCherri而产生的20岁以下基因座。

  2. ER位置在中未更改多学科发展指数 1卵室。ER标记（ER‐GFP）以wt和多学科发展指数 1用ATP‐S共同染色的卵腔标记线粒体。内质网位于wt和wt的核周区、细胞质和细胞外周多学科发展指数 1卵室。

数据信息：（A，B）中的比例尺，10μm。
图EV5
图EV5。卵巢新生蛋白合成和稳定蛋白水平的Western blot分析

  1. 卵巢线粒体部分新生蛋白质合成的Western blot分析。新生蛋白合成通过AHA掺入进行标记，并通过抗生物素抗体进行检测。Tom20被用作加载对照。在未经AHA孵育的线粒体部分有两条强带（*），表明两种内源性生物素化线粒体蛋白。AHA信号主要在细胞溶质翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）的存在下被阻断。而氯霉素（CAP）对HpG掺入没有影响，表明新生的蛋白质合成主要来自与线粒体相关的胞质核糖体。

  2. Western blot分析wt细胞溶质部分的新生蛋白合成，多学科发展指数 1、和多学科发展指数 1表达Tom20‐Larp(mdi公司 1/TL）卵巢。Tubulin被用作负荷控制。表明三种基因型中新生蛋白质合成的AHA信号具有可比性。

  3. mtSSB-GFP和mtRNApol‐GFP（mtRP-GFP）在wt和多学科发展指数 1卵巢。肌动蛋白被用作加载控制。

图6
图6。MDI公司‐Larp复合物促进从头开始核编码线粒体蛋白子集的合成或导入

  1. 检测卵巢线粒体部分的新生蛋白质合成。通过AHA掺入监测恶心的蛋白质合成，并通过抗生物素抗体检测。Tom20充当加载控件。注意，核编码线粒体蛋白的合成在多学科发展指数 1背景，并通过过度表达Tom20‐Larp恢复(多学科发展指数 1/TL）。

  2. wt卵巢线粒体蛋白质的蛋白质印迹，多学科发展指数 1、和多学科发展指数 1表达Tom20‐Larp的苍蝇(多学科发展指数 1/TL）融合蛋白。注意，Tamas、TFAM、mRpL19和COX4的水平在多学科发展指数 1苍蝇，但恢复了多学科发展指数 1/TL飞。

  3. Tamas和TFAM的新生蛋白合成在多学科发展指数 1卵巢，而mtSSB没有受到影响。Tfamgfp、Tamasgfp和mtSSBgfp以wt或多学科发展指数 1背景。通过AHA掺入标记新生蛋白，然后用GFP抗体对GFP标记蛋白进行免疫纯化，并用抗生物素抗体检测新生蛋白的合成。

  4. wt 254 nm吸光度的代表性曲线，多学科发展指数 1、和mdi公司 1/TL卵巢提取物。

  5. 多聚体mRNA分析tamas、tfam、mtSSB、cox4、，和百万卢比19单位：wt，多学科发展指数 1、和多学科发展指数 1/TL卵巢。计算并绘制了非多体组分（N.P，包括核糖体亚单位和单体相关）和多体组份（poly）中每个基因的mRNA百分比。分数塔马斯、tfam、cox4、，和mRPL19型多体组分中的mRNA在多学科发展指数 1与wt相比，但在多学科发展指数 1/TL飞。N个=所有样本为4。P（P）‐将重量与多学科发展指数 1:塔马斯,P（P）= 0.0055;tfam公司,对= 0.001;环氧化酶4,P（P）= 0.0066;百万卢比19,P（P）= 0.0097.P（P）‐比较值多学科发展指数 1/TL至多学科发展指数 1:塔马斯,P（P）=0.0206；tfam公司,P（P）= 0.0346;环氧化酶4,P（P）= 0.0036;百万卢比19,P（P）= 0.0016.

  6. COX4和mRPL19的新生蛋白合成在多学科发展指数 1卵巢，但通过过度表达Tom20‐Larp而恢复(mdi公司 1/TL）。用针对内源性蛋白的抗体对这些蛋白进行免疫纯化。

图7
图7。靶向线粒体表面的Larp部分拯救了多学科发展指数 1表型

  1. Tom20-LarpGFP（Tom20-Larp）融合蛋白的线粒体定位多学科发展指数 1用ATP‐S染色的卵室显示线粒体。标尺，20μm。

  2. 不同基因型苍蝇卵孵化率和mtDNA含量与体重控制的关系；每个数据点代表三个独立复制的平均值。误差条代表SD。Tom20‐Larp在多学科发展指数 1(多学科发展指数 1 ; Tom20‐Larp公司)显著恢复mtDNA水平和孵化率。N个孵化率=3×>100枚/基因型。相对mtDNA水平是三个生物重复序列的平均值。P（P）‐比较值多学科发展指数 1 ; Tom20‐Larp公司到多学科发展指数 1：对于mtDNA水平，对= 0.0209; 孵化率，P（P）= 东经3.4758−05.

  3. MDI和Larp在线粒体生物发生中的作用模型。MDI（绿色矩形）定位于线粒体外膜，并将Larp（蓝色矩形）招募到线粒体表面。Larp与多聚体（blob）和翻译刺激物相互作用，并刺激核编码mRNA子集的翻译。线粒体表面合成的蛋白质与Tom–Tim线粒体转运蛋白复合体非常接近，这将促进其快速转运到基质中。MDI‐Larp复合体的靶点包括大多数核编码ETC亚单位、线粒体核糖体蛋白、TFAM和mtDNA聚合酶（Tamas）（统称为红色）。线粒体核糖体是线粒体DNA编码蛋白质的生物生成所必需的，所有这些蛋白质都是ETC亚单位。因此，MDI‐Larp复合物似乎协调了细胞核和线粒体基因组的表达，以促进ETC复合物的生物发生。

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