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.2016年5月18日；15(10):1352-62.
doi:10.1080/15384101.2016.1166319。

mTOR在转录和转录后调节Npm1基因的表达，有助于增强Pten失活细胞的增殖

拉菲克·博德拉 1 2 三, Rosyne Lagrafeuille公司 1 2 三, 科琳·劳斯·卡莱特 1 2 三, 西里尔·德佐西诺 1 2 三, 加列·卢博·列格罗斯 1 2 三, 塞德里克·查韦鲁 4, Jean-Paul Saru公司 1 2 三, 席尔瓦男爵 1 2 三, 劳伦特·莫雷尔 1 2 三, 克劳德·博登 1 2 三
附属机构

mTOR转录和转录后调节Npm1基因表达，以促进Pten失活细胞的增殖

拉菲克·博德拉等。 细胞周期. .

摘要

哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）在调节正常和病理生长条件下的蛋白质合成、细胞大小和代谢等生长相关过程中发挥着重要作用。mTOR的这些功能被认为在很大程度上是其细胞质活性调节翻译速率的结果，但积累的数据强调了这种丝氨酸/苏氨酸激酶在细胞核内的补充作用。事实上，mTOR的核活性目前通过调节参与核糖体生物生成和增殖控制的基因产物的表达，与蛋白质生物合成能力的控制相关。使用原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），我们观察到mTOR信号过度激活的细胞显示出生长相关Npm1蛋白的高丰度，这是Npm1基因调控的一种新机制。我们发现Npm1基因的表达依赖于mTOR，这可以通过处理与雷帕霉素培养的野生型和Pten失活的MEF或通过瞬时转染针对mTOR的小干扰RNA来证明。因此，mTOR激酶在体内定位于Npm1启动子基因，并增强了人类Npm1-核糖核酸酶报告基因的活性，从而提供了直接控制的机会。有趣的是，雷帕霉素并没有从Npm1启动子中去除mTOR，而是通过增加其周转率而强烈破坏了Npm1转录本的稳定性。使用前列腺特异性Pten-deleted小鼠肿瘤模型，发现Npm1 mRNA水平上调，且对雷帕霉素敏感。最后，我们还发现Npm1是促进mTOR依赖性细胞增殖所必需的。因此，我们提出了一个模型，其中mTOR密切参与Npm1基因表达的转录和转录后调节，并在发育和包括癌症在内的疾病中发挥作用。

关键词：Npm1；细胞增殖；基因表达；mTOR；前列腺癌。

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数字

图1。
图1。
Pten灭活的MEF细胞中Npm1 mRNA和蛋白水平增强。（A） 30微克野生型（WT）和Pten公司用SDS-PAGE分离敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞，并用特异性抗体进行免疫印迹（n=3）。（B） RT-qPCR分析Npm1号机组WT和Pten公司KO MEF（相对于36立方英尺4英寸控制WT-MEFs的mRNA基因）。条形图显示了三个独立实验（±SEM）的平均水平，并通过一名学生的测试来评估统计显著性**第页< 0.01.
图2。
图2。
抑制mTOR信号减少Npm1号机组MEF中的表达式。（A） 培养野生型（WT）和Pten公司敲除（KO）细胞在没有或存在20 nM雷帕霉素的情况下处理24小时。制备细胞提取物，并使用SDS-PAGE对含有30µg总蛋白的等分样品进行解析，以通过Western blotting进行蛋白质可视化。（B） 除雷帕霉素添加到培养基中4小时外，细胞按上述方式培养。Npm1号机组和mTOR公司然后通过RT-qPCR从WT和KO MEFs分离的mRNA中分析表达水平Pten公司通过与36亿4信使核糖核酸。条形图显示了至少三个qPCR-扩增的独立实验（±SEM）的平均水平Npm1号机组（对照未经处理的WT MEF细胞标准化为1.0）。（C） Western blot分析用siRNA池（50 nM）处理48小时的MEF细胞中总Npm1和mTOR对抗mTOR。β-肌动蛋白水平显示为负荷控制。（D） RT-qPCR分析Npm1号机组mTOR耗尽后的表达。误差条表示归一化为WT未处理细胞的平均值±SEM（n=3；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001).
图3。
图3。
mTOR结合和激活Npm1号机组发起人。（A） 内源性mTOR与Npm1号机组启动子区以雷帕霉素依赖性方式存在。使用WT和Pten公司在没有或存在20 nM雷帕霉素的情况下进行4小时的KO MEF。mTOR绑定到Npm1号机组启动子和Pol-III转录tRNA精氨酸/酪氨酸使用材料和方法中描述的PCR引物集进行测定。使用兔IgG作为阴性对照。（B）Npm1号机组是mTOR的转录靶点。HeLa（左）和MEF（中）细胞系共转染48小时，共转染200 ng hNPM1型-编码人控制下的萤光素酶的luc质粒NPM1型启动子区域和pCMV-Flag mTOR载体的增加量（100、200和500 ng）。转染h的WT-MEF细胞荧光素酶活性的测定NPM1型-luc或CMV公司-luc标准化为1，然后计算相对折叠诱导的荧光素酶活性Pten公司相同实验条件下的KO MEF（右）。误差条代表±SEM（n=3；星号，第页< 0.05; 两个星号，第页< 0.01; 三个星号，第页< 0.001).
图4。
图4。
雷帕霉素增加mTOR信号抑制Npm1号机组mRNA转换。早期对数期生长MEF的总mRNA用于qPCR分析Npm1号机组表达式。如图所示，用放线菌素D（5µg/ml）、雷帕霉素（20 nM）或雷帕霉素加放线菌肽D处理细胞。10小时后收集细胞，提取总mRNANpm1号机组表达式计算。与载体交替处理的WT MEF中的mRNA水平被认为是100%。数据是3个独立实验的代表，表示为相对于WT车辆处理MEF的折叠变化，作为mRNA水平比较定量分析的校准物。每个样品测量三份，条形图代表平均值±SEM(*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001).
图5。
图5。
Npm1在小鼠前列腺肿瘤中的过度表达Pten公司这种损失对雷帕霉素对mTOR的慢性抑制很敏感。（A） 纯合子Pten公司缺失增加了小鼠前列腺背外侧叶Npm1的丰度。从三个月大的动物身上制备蛋白裂解物，并用所示抗体通过免疫印迹法进行检测。（B） 慢性mTOR抑制降低了Npm1的丰度Pten公司-前列腺癌无效。三个月大Pten公司条件敲除小鼠长期给予载体或雷帕霉素（10mg/kg/天）。4天后Pten公司-通过SDS-PAGE分离无效前列腺叶，并使用所指示的抗体通过蛋白质印迹进行测定。代表性斑点来自每组2只不同的动物。相比Pten公司用雷帕霉素处理过的动物作为载体（第1和第2车道）治疗的敲除小鼠（第3和第4车道）。
图6。
图6。
Pten公司具有过度活化mTOR的MEFs中缺失诱导的增殖需要Npm1。（A） 指数增长的MEF转染了特异性Npm1号机组或控制GFP（Ctrl）siRNA。50 nM转染后24小时Npm1号机组和Ctrl键GFP公司制备siRNAs、全细胞提取物，并使用Npm1和β-肌动蛋白抗体进行蛋白质凝胶印迹，以控制负荷。（B） Npm1缺失通过过度激活mTOR信号逆转Pten-loss诱导的MEF过度增殖。Pten的野生型和灭活MEF分别以17.5×10的密度进行电镀三和7.5×10三将每孔的细胞转染到96 wells平板中，1天后用任一种方法转染Npm1号机组和Ctrl键GFP公司siRNA。24小时后，更换培养基，根据材料和方法使用BrdU试剂检测细胞增殖。（C） Npm1沉默降低了Pten失活诱导的上调的Cyclin D1蛋白水平。如上所述转染删除的Pten MEF，并用细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞因子E和细胞周期蛋白B1抗体对等量细胞的总蛋白裂解物进行Western blot分析。β-肌动蛋白水平显示为负荷控制。（n=3）*第页< 0.05.
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