跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2016年6月10日;291(24):12445-12466.
doi:10.1074/jbc。M115.709485。 Epub 2016年3月30日。

从rTg4510小鼠脑中分离的胞外囊泡种子Tau蛋白聚集的阈值依赖性

附属公司

从rTg4510小鼠脑中分离的细胞外小泡以阈值依赖的方式种子Tau蛋白聚集

胡安·卡洛斯·波兰科等。 生物化学杂志. .

摘要

微管相关蛋白tau在阿尔茨海默病和相关tau病中起着关键作用。越来越多的证据表明,τ聚集体以类似朊病毒的方式传播和复制,病理性τ种子的摄取导致受体细胞中单体τ的错误折叠和聚集。在这里,我们重点研究了从tau转基因rTg4510和对照小鼠的大脑中分离出的富含外泌体的小细胞外囊泡。我们发现这些细胞外囊泡含有tau,尽管在具有明显tau病理学的转基因小鼠中,tau的水平明显较高。小泡中的Tau被不同程度地磷酸化,尽管磷酸化程度低于其来源的脑细胞。细胞外囊泡中未检测到一些被认为对τ病理学至关重要的磷酸化蛋白(AT8、AT100和AT180)。尽管如此,当用FRET tau生物传感器细胞进行检测时,来自转基因小鼠的细胞外囊泡能够以阈值依赖的方式播种tau聚集。我们还观察到,用于标记细胞外囊泡膜的染料在tau内含物的成核和形成过程中仍然存在,这表明膜在接种或降解过程中发挥作用。总之,我们清楚地证明细胞外小泡可以传播tau病理。这表明细胞外小泡在τ病理的传播和传播中发挥作用。细胞外囊泡中tau的特征和我们确定的种子阈值可能解释为什么tau病理学在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中发展非常缓慢。

关键词:阿尔茨海默病;Tau蛋白(Tau);外体(囊泡);磷酸化;tau病。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
从P301L-tau转基因rTg4510小鼠大脑中分离的纳米囊泡的物理分析。根据Perez-Gonzalez的研究,从大脑细胞外空间分离出了类外显子EV等。(20).A类蔗糖F1-F6的透射电镜分析显示,纳米泡主要位于F2(0.6蔗糖,ρ=1.08g/ml)和F3(0.95蔗糖,ρ=1.12g/ml)。比例尺=100纳米。B类,使用qNano仪器(Izon)的可调谐电阻脉冲传感。尺寸分布的浓度直方图(尺寸单位:纳米每毫升颗粒数)显示了不同蔗糖组分(F1-F6)中的每个群体。与透射电子显微镜一致,在F2中发现了最高浓度的纳米囊泡(0.6)和F3(0.95). 尺寸分布与WT和rTg4510 Tg纳米囊泡的外泌体相容,F3的平均尺寸为130 nm(0.95蔗糖)以及WT和Tg样品中最常见的~74 nm纳米囊泡尺寸。然而,一些较大的细胞外囊泡(>130nm)与这些潜在的外泌体共同分离。与Tg样品相比,从WT样品中获得了更多外显体样EV。
图2。
图2。
分离EV中蛋白质含量的分析。所示为FLOT1、ALIX和TAU表达的定量Western blotting分析。F3 EV和整个对照细胞提取物装载相同数量的蛋白质(20μg)(C.E公司).误差条代表S.E(n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ****,第页< 0.0001.A类,FLOT1蛋白质水平的量化,显示出非常强的富集。B类ALIX是内吞途径的外体标志物,其蛋白质水平也得到了富集。C类,总tau蛋白水平的定量。D–I型,WT和Tg小鼠外泌体分离物不同蔗糖部分的代表性Western blot,显示ALIX和FLOT1表达(D类E类)以及用Tau5抗体检测到的总tau(小鼠和人类)(F类G公司). 请注意底部面板(F类G公司)对于Tau5过度暴露,显示出高分子量(兆瓦)F3中的蛋白质,强度在150 kDa左右(星号),表明EV中可能存在tau三聚体。F5和F6显示连续的高分子量涂片,表明透射电子显微镜观察到的一些聚集物(图1)可能是游离τ聚集物,其在高浓度蔗糖(59)下沉积。H(H)检测了类外泌体EVs蔗糖组分中细胞质细胞器的标记物:线粒体(VDAC1)、早期内体(EEA1)和内质网标记物(calnexin)。
图3。
图3。
从小鼠脑中分离出的类外泌体EV中存在极低水平的磷酸化依赖性τ表位。显示了蔗糖组分F1-F6的Western blotting分析,测试了不同的AD-相关的磷-金表位。F3外泌体样EVs和全细胞裂解物对照组加载20μg总蛋白。误差条代表S.E(n个= 3). *,第页< 0.05; ***,第页< 0.001; ****,第页<0.0001;纳秒,不显著。A类、成对螺旋丝状-金磷酸核苷和其他蛋白质的代表性Western blot。兆瓦,分子量;C.E公司,细胞提取物。B–G类,蛋白质水平的量化(B类)AT8(C类)AT100(D类)在180(E类)AT270(F类)序列(P)-262,和(G公司)序号(P)-422。分析表明,F3富含胞外体标记,包含磷酸化表位AT270、Ser(P)-262和Ser(P)-422。有趣的是,在类外泌体EV中未检测到AT8、AT100和AT180磷酸酯类。H(H),神经元特异性III类β-微管蛋白(TUJ1)的蛋白水平,证明EV的神经元起源。,在蔗糖组分F3(0.95)中使用类外泌体EV进行PK表面刮除蔗糖)。用Tau5抗体测定总tau。上清液中未发现tau(S公司)PK治疗后。Tau与颗粒有关(P(P))WT和Tg小鼠离心后的完整外泌体样EV。将PK添加到裂解的EV中时,Tau蛋白完全降解(L(左)).
图4。
图4。
外显体样EV可诱导FRET tau生物传感器细胞内源性tau聚集。FRETτ生物传感器细胞是同时表达τ-CFP和τ-YFP(RD域)的HEK293T细胞。24小时后用FRET流式细胞仪对细胞进行处理和分析(n个=3,平均±S.D.,分析20000个细胞/实验)。代表性的流式细胞术图显示了在右门中检测到的FRET信号(Q2,阴影绿色).A类,滴定蛋白质样品,以确定FRET tau生物传感器细胞接近饱和的浓度。用含有脂多糖胺的rTg4510转基因脑细胞裂解物减少量处理细胞,并在处理24小时后通过FRET流式细胞仪进行分析。细胞裂解物中的20μg蛋白质足以产生FRET信号,该信号不比仅用1.0或0.5μg蛋白质获得的信号低多少。即使有8 ng蛋白质,也能检测到FRET信号。因此,细胞在20μg细胞裂解液中饱和,并检测低纳克范围内的τ种子。这意味着在20μg蛋白质中甚至可以检测到微量的τ种子。前任,励磁。B–J类、脂蛋白的需求分析。FRET tau生物传感器细胞在存在的情况下处理(C类,D类,G公司,以及H(H))或缺席(E类,F类,,以及J)含载脂蛋白(B类)显示FRET闸门中缺少信号(右上闸门Q2,阴影绿色).C–F类,WT-EV或细胞裂解物处理均不能诱导FRET。G–J型,用Tg细胞裂解物检测到强FRET信号(G公司)和Tg电动汽车(H(H)),但仅在存在脂质乙胺的情况下。J,相同的Tg样品,不使用Lipofectamine。
图5。
图5。
扩展培养物对FRET信号生成和τ聚集的影响。FRET tau生物传感器细胞在存在的情况下处理(B类,C类,F类,以及G公司)或缺席(D类,E类,H(H),以及)经72小时治疗后,用FRET流式细胞仪进行分析(n个=3,平均±S.D.。分析40000个细胞/实验)。A类,仅用脂多糖胺处理的FRETτ生物传感器细胞不会诱导FRET(右上门Q2,阴影绿色).前任,激励。B–E类,WT外泌体样EV或细胞裂解物治疗均未触发FRET。F类G公司,用Tg细胞裂解物检测到强FRET信号(F类)和Tg外泌体样EV(G公司)在脂多糖胺存在下。H(H),如果省略了脂多糖胺,则检测到Tg裂解物的微弱信号(H(H))也适用于Tg电动汽车(一) ●●●●。J–R公司在相同条件下对盖玻片上生长的细胞进行平行实验,然后用共焦显微镜进行分析。比例尺=50微米。O–R(运行-恢复),诱导的tau聚集体仅用Tg样品可见。S公司,量化处理72h后由原子核所占面积归一化的τ包裹体所占面积的比率(τ聚集体/DAPI,单位:%,n个= 4).
图6。
图6。
蛋白质和类外泌体EV的远红外荧光标记。 A类脑细胞裂解物中存在的游离蛋白质和蛋白质聚集体的标记策略。胺反应Alexa Fluor 647(AF647)标记可用的N端子。未反应的标记被尺寸排除色谱法丢弃,该色谱法仅回收AF647标记的蛋白质和40kDa以上的聚集物。RT公司,室温。B类,使用亲脂远红外染料(Cell Vue Claret)标记EV膜的概述。亲脂细胞Vue Claret以高亲和力结合到EV膜的脂质双层中。用1%牛血清白蛋白螯合微量的未结合染料,并通过超速离心和PBS洗涤进一步纯化标记的外泌体样EV。值得注意的是,荧光标记位于类外泌体EV的膜中,而不是蛋白质中。
图7。
图7。
脂质内酰胺增加EV和蛋白质聚集体的摄取,从而触发与内化种子密切相关的细胞内tau内含物。 A–K型,tau生物传感器细胞在存在的情况下处理(B类,C类,F类,G公司,J,以及K(K))或缺席(D类,E类,H(H),以及)治疗24小时后,通过共焦显微镜分析脂多卡因。为了观察细胞的摄取,细胞裂解物用AF647标记在蛋白质的N末端。EV的膜用亲脂远红外染料Cell Vue Claret(CV)标记,以进行类似的内化分析。通过绿色/黄色发射(530-600 nm)检测内源性τ。比例尺=50微米(A–K型)和20μm(M(M)N个).A类,FRET tau生物传感器细胞仅用脂质体载体处理。没有检测到远红外线信号,因为没有添加外显体样EV或细胞裂解物。B–E类标记WT外体样EVs或WT细胞裂解物的处理均未诱导内源性tau的聚集。F–I,用标记的Tg细胞裂解物或类外泌体EV治疗。AF647 Tg细胞裂解物可显示明亮的τ包裹体(F类)和CV-Claret Tg EV(G公司)在脂多糖胺存在下。AF647 Tg细胞裂解物也检测到Tau内含物(H(H))或CV-Claret Tg EV()在不含脂蛋白的情况下。J–K,脂质内酰胺介导P301L Tg细胞裂解物和无远红外标记的外泌体样EV的摄取,用作阳性对照。L(左),Tg样品处理24小时后检测到的细胞核面积上归一化的诱导τ聚集体面积比率的量化,如所示F–I(τ骨料/DAPI,百分比,n个= 4).M(M)N个,远红外标记Tg细胞裂解物内化的高倍图像(M(M))和Tg外泌体(N个)在脂多糖胺存在下。M(M)tau内含物形成于内部化的外源蛋白聚集体附近,有时完全包围种子。N个内化的外泌体样EV也存在这种情况,其中膜仍显示Cell Vue Claret染色,而EV使细胞内tau内含物形成核。Cell Vue Claret的信号表明,有一个分隔膜参与将τ种子呈现给细胞以触发聚集。
图8。
图8。
细胞裂解物中外体样EV和蛋白质的摄取水平决定FRET信号的产生。Tau生物传感器细胞在现场处理(B类,C类,F类,G公司,J,以及K(K))或缺席(D类,E类,H(H),以及)并在24小时处理后通过FRET流式细胞术进行分析。为了定量摄入,蛋白细胞裂解物用AF647标记,EV膜用CV Claret标记。代表不同吸收水平的任意门(低,L(左); 中等,M(M); 高,H(H); 未染色细胞,U型)如图所示。每个流式细胞术图下方的相应单独表格中描述了所示每个闸门中的细胞百分比(n个=3,平均±S.D.,分析40000个细胞/实验)。A类,FRET tau生物传感器细胞在仅用脂质体载体处理时不显示FRET(右侧门,阴影绿色)由于未添加外显体样EV或细胞裂解物,因此未显示远红外信号。B–E类标记WT外体样EVs或WT细胞裂解物的处理均未诱导FRET。然而,对摄取的远红外分析表明,tau生物传感器细胞在不含脂多糖胺的情况下将细胞裂解物和WT样品的整个EV中的蛋白质内化(D类E类),但摄取量随着脂质乙胺的增加而增加(B类C类).F类G公司,在Lipofectamine存在下用Tg细胞裂解物或EV处理的Tau生物传感器细胞。AF647 Tg细胞裂解物检测到强FRET信号(F类)和CV Claret Tg外泌体样EV(G公司). 在脂质体的存在下,大多数细胞达到了高水平的摄取。因此,大多数显示FRET的细胞是那些对远红外标记Tg样品摄取水平最高的细胞。H(H),AF647 Tg细胞裂解物未检测到FRET事件(H(H))或CV Claret Tg EV()在不含脂蛋白的情况下。大多数细胞仅达到中等水平的摄取。JK(K),用P301L Tg细胞裂解物和没有远红外标记的外泌体样EVs处理作为阳性对照。
图9。
图9。
EV簇的诱导和Alix和flotillin-1的免疫共定位。 I–L型,用Cell Vue Claret标记小鼠脑源EV,并用脂质十六胺处理,用于Alix和flotillin-1的免疫荧光分析。A–D,未经脂多糖胺治疗的EV作为对照。相应的灰度转换查找表图像显示在每个免疫荧光图像的下方,以便更好地显示(E–H(E–H)M–P). 图中显示的是Alix的共同本地化,主要以标点符号的方式表示(亮绿色圆点)和舰队-1。结肠化不依赖于脂多糖胺治疗。然而,脂多糖胺增加了EV的结合能力并诱导EV簇的形成,这也提高了免疫荧光检测的灵敏度。电动汽车集群的规模各不相同。比例尺=10微米。
图10。
图10。
Alix和flotillin-1在细胞摄取后也在EV上免疫共定位。图中显示了脂质内酰胺介导的tau生物传感器细胞标记Cell Vue Claret的小鼠脑源EV的内化。这个箭头指示Alix和flotillin-1共定位的位置。相应的灰度转换查找表图像显示在每个免疫荧光图像的下方,以便更好地显示(E–H(E–H)M–P).A–DWT小鼠的外显体样EV(Wt-EV汽车)被强烈内化,但未能参与tau聚合。然而,形成细胞内点状突起的ALIX和FLOT-1在内化EV中共定位(箭头).I–L型,来自rTg4510转基因小鼠的外泌体样EVs(Tg-EV)强诱导细胞内tau内含物(亮绿色)在受体细胞中。在重组细胞质的中间,观察到ALIX和FLOT-1的一些共定位,有时埋藏在τ内含物内的EV中(箭头).比例尺=20微米。
图11。
图11。
脂多糖胺增加外源种子的吸收,并以剂量依赖的方式加速播种过程。在所示的所有条件下,用等量的转基因细胞裂解液处理Tau生物传感器细胞。然而,Lipofectamine在2倍稀释时逐渐减少,并在24小时处理后通过FRET流式细胞术进行分析(n个=3,平均±S.E.,每次实验分析40000个细胞)。A–D代表性治疗的流式细胞仪图显示,在治疗中添加较少的脂质己内酰胺,导致τ聚集的FRET事件较少。FRET信号在右栅极(Q2,阴影部分绿色).前任,励磁。E类对不同治疗方法检测到的FRET事件百分比进行量化,揭示了对脂质内酰胺浓度的剂量依赖性反应。误差条代表S.E(n个= 3). ****,第页< 0.0001.F类,关于脂多卡因对tau生物传感器细胞治疗作用的概念。我们的研究支持了这样的观点,即脂质内酰胺增加了外源性τ种子的吸收,这对形成τ内含物的细胞决定有着深远的影响。需要大量摄取错误折叠的τ种子才能触发细胞内内源性τ种子。这与此细胞决策中涉及的种子阈值的操作兼容。在缺乏脂多糖胺的情况下,接种过程缓慢且效率低下,这可能是tau病患者tau病理进展缓慢的原因之一。
图12。
图12。
只有携带tau内含物的细胞才能分泌携带tau种子的外泌体样EVs。Tau生物传感器细胞被用作体外从诱导tau聚集的细胞系中分离外泌体的细胞模型。比例尺=50微米(A类,B类,F类,以及G公司)和100纳米(C类D类).A类,用WT小鼠脑细胞裂解物处理τ生物传感器细胞,生成无τ聚集的培养物的荧光活细胞成像。B类,形成tau内含物的细胞培养(亮绿色骨料)用rTg4510脑裂解物处理tau生物传感器细胞获得。C类D类从WT CCM中分离出的类外泌体EV的电子显微镜(C类,Wt-EV汽车)或Tg细胞培养物(D类,Tg-EV)表明这两种培养物产生的EV大多小于100 nm直径。E类,分离EV的Western blotting分析。5μg蔗糖纯化EV的蛋白质当量(F3,0.95蔗糖)。包括相应细胞裂解物的5μg和20μg蛋白质进行比较。使用相等的蛋白质量,EV和细胞裂解物都显示出胞外体标记物ALIX和FLOT-1的强烈上调。内质网标志物calnexin(加拿大)无法检测到。tau-RD4抗体检测到总tau,表明tau在WT和Tg EV中的存在水平相似。SDS-稳定高分子量(兆瓦,星号)仅用20μg转基因细胞裂解液检测到tau物种。在经历细胞tau聚集的细胞中检测到tau磷酸化增加(Ser(P)-262)。然而,根据EV蛋白的数量分析,未检测到Ser(P)-262。C.E公司,细胞提取物。F类来自WT培养物的外显体样EV(WT-EVs+Lipofectamine)无法在原始tau生物传感器细胞中诱导tau聚集。G公司,用Tg-EVs+Lipofectamine处理的tau生物传感器细胞的荧光活细胞成像,显示诱导的tau聚集体的存在。H(H),5μg WT EV蛋白当量处理的FRET流式细胞术(H(H))和Tg电动汽车()表明只有Tg-EV能够生成指示τ聚集的FRET信号(n个=3,平均±S.D.,每次实验分析40000个细胞)。前任,励磁。JHEK293衍生EV的ThT荧光分析(n个=3,平均荧光±S.E。;美国。,任意单位)。Tg-EVs中ThT荧光相对较强的增加表明错误折叠和聚集的τ的存在较高。

类似文章

引用人

  • 在四重复τ蛋白病中,Tau积累与体内多巴胺缺乏有关。
    Ferschmann C、Messerschmidt K、Gnörich J、Barthel H、Marek K、Palleis C、Katzdobler S、Stockbauer A、Fietzek U、Finze A、Biechele G、Rumpf JJ、Saur D、Schroeter ML、Rullmann M、Beyer L、Eckenweber F、Wall S、Schildan A、Patt M、Stephens A、Classen J、Bartenstein P、Seibly J、Franzmeier N、Levin J、Höglinger GU、Sabri O、Brendel M、Scheif标高M;德国Taopathies成像倡议(GII4T)。 Ferschmann C等人。 Eur J Nucl Med Mol成像。2024年2月17日。doi:10.1007/s00259-024-06637-6。打印前在线。 Eur J Nucl Med Mol成像。2024 PMID:38366196
  • 细胞外囊泡的出现是神经疾病的“液体活检”:繁荣还是萧条。
    Kumar A、Nader MA、Deep G。 Kumar A等人。 药理学修订版2024年2月13日;76(2):199-227. doi:10.1124/pharmrev.122.000788。 药理学修订版2024。 PMID:38351075 免费PMC文章。 审查。
  • 细胞外囊泡研究的最少信息(MISEV2023):从基本方法到高级方法。
    威尔士JA、Goberdhan DCI、O'Driscoll L、Buzas EI、Blenkiron C、Bussolati B、Cai H、Di Vizio D、Driedonks TAP、Erdbrügger U、Falcon-Perez JM、Fu QL、Hill AF、Lenassi M、Lim SK、Mahoney MG、Mohanty S、Möller A、Nieuwland R、Ochiya T、Sahoo S、Torrecilhas AC、Zijlstra A、Abuelreich S、Bagabas R、Bergese P、Bridges EM、Brucale M、Burger D,Carney RP、Coccci E、Crescitelli R、Hanser E、Harris AL、Haughey NJ、Hendrix A、Ivanov AR、Jovanovic-Talisman T、Kruh-Garcia NA、Ku'ulei-Lyn Faustino V、Kyburz D、Lässer C、Lennon KM、Lötvall J、Maddox AL,Martens-Uzunova ES、Mizenko RR、Newman LA、Ridolfi A、Rohde E、Rojalin T、Rowland A、Saftics A、Sandau US、Saugstad JA、Shekari F、Swift S、,Ter Ovaneyan D、Tosar JP、Useckaite Z、Valle F、Varga Z、van der Pol E、van Herwijnen MJC、Wauben MHM、Wehman AM、Williams S、Zendrini A、Zimmerman AJ;MISEV财团;Théry C,Witwer KW公司。 威尔士JA等人。 《细胞外囊泡》。2024年2月;13(2):e12404。doi:10.1002/jev2.12404。 《细胞外囊泡》。2024 PMID:38326288 免费PMC文章。
  • 蛋白质聚集物的大脑清除:星形胶质细胞特写。
    Giusti V、Kaur G、Giusto E、Civiero L。 Giusti V等人。 摩尔神经变性剂。2024年1月16日;19(1):5. doi:10.1186/s13024-024-00703-1。 摩尔神经变性剂。2024 PMID:38229094 免费PMC文章。 审查。
  • 收集海马间质液细胞外囊泡(EV)的新方法ISF公司)揭示了小胶质细胞EV蛋白质组中的性别依赖性变化对Aβ病理学的响应。
    Pait MC、Kaye SD、Su Y、Kumar A、Singh S、Gironda SC、Vincent S、Anwar M、Carroll CM、Snipes JA、Lee J、Furdui CM、Deep G、Macauley SL。 Pait MC等人。 《细胞外囊泡》。2024年1月;13(1):e12398。doi:10.1002/jev2.12398。 《细胞外囊泡》。2024 PMID:38191961 免费PMC文章。

工具书类

    1. Frost B.、Götz J.和Feany M.B.(2015)《连接τ功能障碍和神经变性之间的点》。趋势细胞生物学。25, 46–53-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Walker L.C.和Jucker M.(2015)《神经退行性疾病:扩展朊病毒概念》。每年。神经科学评论。38, 87–103-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Braak H.和Braak E.(1995)阿尔茨海默病相关神经纤维改变的分期。神经生物学。年龄16271–278岁;讨论278–284-公共医学
    1. Attems J.、Thal D.R.和Jellinger K.A.(2012)《皮层下τ病理学与阿尔茨海默病之间的关系》。生物化学。社会事务处理。40, 711–715-公共医学
    1. Guo J.L.和Lee V.M.(2011)通过病理性Tau构象对正常Tau进行播种,从而驱动阿尔茨海默样缠结的发病机制。生物学杂志。化学。286, 15317–15331-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型