Methylation-regulated miR-124-1 suppresses tumorigenesis in hepatocellular carcinoma by targeting CASC3

doi:10.18632/oncotarget.8266

.2016年5月3日；7(18):26027-41.

doi:10.18632/目标8266。

甲基化调控的miR-124-1通过靶向CASC3抑制肝癌的发生

附属公司

¹同济大学医学院上海第十人民医院消化科，上海200072。
²上海同仁医院消化科，上海交通大学医学院附属，上海200336。

采购管理信息： 27029030
预防性维修识别码： PMC5041962
内政部： 10.18632/目标8266

甲基化调控的miR-124-1通过靶向CASC3抑制肝癌的发生

凌旭等。 Oncotarget公司. 2016.

.2016年5月3日；7(18):26027-41.

doi:10.18632/目标8266。

作者

附属公司

¹同济大学医学院上海第十人民医院消化科，上海200072。
²上海同仁医院消化科，上海交通大学医学院附属，上海200336。

采购管理信息： 27029030
预防性维修识别码： PMC5041962
内政部： 10.18632/目标8266

摘要

本研究旨在探讨miR-124-1在肝细胞癌（HCC）中的作用及其机制。我们分析了miR-124-1在人肝癌组织和细胞系中的表达。荧光素酶报告子分析用于分析miR-124-1的靶点。用表达miR-124-1的慢病毒转导人肝癌细胞株，并分析其增殖和集落形成。在裸鼠中评估过表达miR-124-1的人肝癌细胞的生长。western blotting和免疫组化检测p38-MAPK、JNK、ERK及相关信号分子的表达。我们的结果表明，与癌旁组织和正常肝细胞系相比，肝癌组织和细胞系中miR-124-1的水平分别降低。肝癌细胞系中miR-124-1的下调归因于其启动子区的高甲基化。miR-124-1的过度表达在体外抑制了HCC细胞的增殖，而miR-124-2与HCC患者的临床病理参数相关。肝癌细胞介导的miR-124-1在裸鼠体内的过度表达抑制了肿瘤生长。通过计算分析和实验测定，肿瘤易感性候选基因3（CASC3）被确定为miR-124-1的直接靶点。MiR-124-1介导的CASC3下调导致p38-MAPK、JNK和ERK失活。我们的发现为肝癌的预防或治疗提供了潜在的新靶点。

关键词：CASC3；肝细胞癌；甲基化；miR-124-1。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。肝细胞癌中microRNA的异常表达**
**答：。**HCC中人类microRNAs（miRNAs）与染色体不稳定位点的比对。B。HCC染色体8p23.3-21.3中断点相关miRNA的改变。**C、。**肝癌细胞株染色体8p23.3-21.3中miRNA的表达**与正常人肝细胞系LO2相比P<0.01，*与LO2相比，P<0.05；^ΔΔ与正常人肝细胞系QSY-7701相比P<0.01，^Δ与QSY-7701相比，P<0.05。

**图2。肝癌细胞中miR-124-1启动子的甲基化**
**答：。**用50 mM 5-Aza-CdR治疗前后6个细胞系，即2个正常肝细胞系（QSG-7701和LO2）和4个恶性细胞系（MHCC-LM3、Huh7、MHCC-97L和HepG2）的PCR分析。SssI甲基化酶为甲基化阳性对照。结果显示为平均值±sd（n¼3）。B。六种细胞系中miR-124-1的5′CpG岛的MSP分析。**C、。**两个正常和四个恶性株系miR-124-1 CpG岛甲基化亚硫酸氢盐序列PCR分析。垂直条表示单个CpG二核苷酸。前miR-124-1序列的位置由黑盒表示，转录起始位点指定为+1。每个红色竖线代表一个单独的CpG位点，测序位置由一个红色框指示。D。miR-124-1的相对表达水平表示为相对于未处理对照的折叠变化。该分析在三个重复孔中进行，并重复三次，每次都获得类似的结果。

图3
**答：。**根据miR-124-1表达水平分组的肝癌患者的Kaplan-Meier生存分析。我们发现，miR-124-1的表达与肝癌患者的总体生存率没有显著相关性（P=0.117）。B。实时PCR比较8对肝癌组织和邻近非癌组织中miR-124-1的表达。使用Student t检验计算癌组织和相邻非癌组织之间差异的统计学意义。（P=0.029）。

**图4。MicroRNA-124-1通过直接靶向其3′-UTR下调CASC3表达**
**答：。**推测CASC3 mRNA的3′-UTR中的miR-124-1结合序列。在荧光素酶报告基因下游克隆了含有野生型或突变型miR-124.1结合序列的人CASC3 3′-UCR片段。将HEK293细胞与miR-124或对照载体和含有野生型或突变体CASC3 3′-UTR的荧光素酶报告构建体共转染。转染后48小时测定萤光素酶活性。通过雷尼拉萤光素酶活性对每个样品的萤火虫萤光素酶活性进行标准化。将数据归一化为用对照载体转染的细胞中检测到的荧光素酶活性，而对照载体的荧光素酶活性不显著。B。通过实时PCR和western blotting检测miR-124-1过度表达对内源性CASC3表达的影响。β-actin作为内部控制。**C、。**分别用原位杂交和免疫组织化学方法检测miR-124-1和CASC3蛋白的表达。

**图5。CASC3介导miR-124-1的抑瘤作用**
**答：。**用CASC3的siRNA转染MHCC-LM3和Huh7细胞。B。使用慢病毒感染系统生成稳定表达CASC3、miR-124-1和对照载体的MHCC-LM3和Huh7转染体。通过western blotting（A-A，B-A）确认CASC3蛋白表达水平。通过CCK-8（A-b，b-b）和集落形成分析（A-c，b-c）测定HCC细胞生长。结果显示为三个独立实验中获得的值的平均值±sd。使用Student t检验计算统计显著性。*P<0.05。

**图6。miR-124-1对裸鼠移植瘤形成的影响**
裸鼠对侧皮下注射5×10⁶控制慢病毒载体感染细胞和miR-124-1载体感染细胞。2周后，当肿瘤直径达到1.0 cm，皮下肿瘤切成1.0 mm时，处死小鼠^三然后将切片插入另外10只裸鼠的肝脏。对小鼠进行30天的随访，然后通过颈椎脱位将其杀死。用高清数码相机对肝脏和肺部进行了切除和成像。每组由5只小鼠组成。使用Student t检验比较两组肿瘤的重量。**答：。**控制慢病毒载体组；B。miR-124-1载体组；**C、。**Sh-CASC3组。

**图7。miR-124-1通过p38-Akt-JNK途径抑制肿瘤发生**
**A、 B。**在用si-CASC3转染的MHCC-LM3（A）和Huh7（B）细胞中评估JNK途径的活性。在用编码CASC3的慢病毒载体（没有3′-UTR的开放阅读框）转导后，评估用对照慢病毒载体或miR-124-1表达的慢病毒载体感染的HCC细胞中JNK途径的活性。

**图8。对原位移植miR-124-1载体和对照载体转染MHCC-LM3细胞的肝癌组织进行CASC3、p-JNK和p-ERK的免疫组织化学研究**
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