Caspase-2 resides in the mitochondria and mediates apoptosis directly from the mitochondrial compartment

doi:10.1038/cddiscovery.2016.5

.2016年2月15日2:16005。

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半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2存在于线粒体中，直接从线粒体室介导细胞凋亡

洛佩兹·克鲁赞¹, R夏尔马¹, M蒂瓦里¹, S卡尔巴赫¹, D霍尔斯坦¹, C R马丁¹, J D Lechleiter公司², B赫尔曼¹

附属公司

¹德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心细胞和结构生物学系，地址：7703 Floyd Curl Drive，MED 238D.2，San Antonio，TX 78229-3900，USA。
²德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心细胞和结构生物学系，地址：7703 Floyd Curl Drive，MED 238D.2，San Antonio，TX 78229-3900，USA；美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心生物医学神经科学中心，邮编78229。

PMID： 27019748
预防性维修识别码： PMC4806400美元
内政部： 10.1038/cd发现.2016.5

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2存在于线粒体中，直接从线粒体室介导细胞凋亡

洛佩兹·克鲁赞等。细胞死亡发现. 2016.

.2016年2月15日2:16005。

doi:10.1038/cddiscovery.2016.5。

作者

洛佩兹·克鲁赞¹, R夏尔马¹, M蒂瓦里¹, S卡尔巴赫¹, D霍尔斯坦¹, C R马丁¹, J D Lechleiter公司², B赫尔曼¹

附属公司

¹德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心细胞和结构生物学系，地址：7703 Floyd Curl Drive，MED 238D.2，San Antonio，TX 78229-3900，USA。
²德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心细胞和结构生物学系，地址：7703 Floyd Curl Drive，MED 238D.2，San Antonio，TX 78229-3900，USA；美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心生物医学神经科学中心，邮编78229。

PMID： 27019748
预防性维修识别码： PMC4806400型
内政部： 10.1038/cd发现.2016.5

摘要

Caspase-2在包括氧化应激在内的多种刺激诱导的细胞凋亡中起着重要作用。然而，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2的亚细胞定位，尤其是其在线粒体中的存在尚不清楚。目前尚不清楚细胞溶质caspase-2是否移位到线粒体以触发凋亡的内在途径，或者是否在线粒体中组成性地存在caspase-2，然后选择性地介导这种凋亡效应。在这里，我们证明了纯化的线粒体组分中存在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2在体外-用免疫印迹和共焦显微镜观察培养细胞和肝细胞。我们通过使用供体和受体荧光团两侧的线粒体靶向底物进行荧光共振能量转移分析，表明线粒体caspase-2具有功能活性。涉及野生型和非野生型肝脏细胞核、细胞溶质和线粒体部分重组的无细胞凋亡分析案例2^-/-小鼠清楚地指出了线粒体胱天蛋白酶2在细胞凋亡中的直接功能作用。此外，细胞色素c（c）从中释放案例2^-/-与对照组相比，经诱导线粒体功能障碍的药物治疗后，细胞数量减少。最后，我们证明案例2^-/-初级皮肤成纤维细胞免受靶向线粒体电子传递链的氧化剂的伤害。综上所述，我们的结果表明，caspase-2存在于线粒体中，对线粒体氧化应激诱导的凋亡至关重要。

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数字

图1
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2定位于线粒体(一)来自小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或肝脏的纯化线粒体提取物中caspase-2的免疫印迹。复合物II（C-II）被用作线粒体（mito）的标记物，也用作负荷控制。GAPDH被用作细胞质（细胞）提取物的负荷控制。WT=野生型和KO=*案例2*^−/−. (b条)对主要MEF进行AIF（红色）和钙网蛋白（绿色）的联合免疫染色(**c（c）**)AIF（红色）和C-II（绿色）(d日)AIF（红色）和Casp2（绿色）(**e（电子）**)MnSOD（红色）和Casp2（绿色），以及(**（f）**)钙网蛋白（CRT；红色）和Casp2（绿色）。所有图像的细胞核均用Hoechst 33342（蓝色）染色。(克)Pearson的相关系数基于三个独立实验中每个样本共12个细胞，以及代表性图像。

图2
线粒体caspase-2可在无细胞系统中触发细胞凋亡。大鼠肝细胞核和爪蟾卵母细胞胞浆与纯化线粒体混合(一)WT或*案例2*^−/−大脑或(b条)WT或*案例2*^−/−肝脏，37˚C孵育4 h.所示为三个独立实验的凋亡效力比率（计算为样品中凋亡细胞核与缓冲液的百分比比率）。(**c（c）**)来自WT或WT的肝细胞核与细胞质和线粒体部分混合的代表性图像*案例2*^−/−4岁的老鼠 h.上面板是各下面板中所示插图的放大图像。面板1-4包含WT细胞质分数，而面板5-8包含*案例2*^−/−细胞质部分。(d日)不同组合在指定时间点的凋亡效力比。

图3
线粒体caspase-2诱导细胞色素*c（c）*释放。爪蟾卵母细胞胞浆与WT或WT纯化线粒体混合*案例2*^−/−大脑，离心分离线粒体和细胞质部分并免疫印迹细胞色素*c（c）*（cyt公司）*c（c）*). (一)来自三个独立实验的代表性印迹；Rec表示重组cytc（c）加载为阳性对照。(b条)肌动蛋白标准化后的密度测定分析。

图4
氧化应激诱导线粒体caspase-2样活性。用（a）mCFP和mYFP的组合，或（b）mCGY或（c）mC2Y转染NIH 3T3细胞，并分析FRET。(一)展示线粒体靶向结构的机械基础的卡通。当线粒体caspase-2在氧化应激条件下裂解mC2Y时，CFP和YFP的接近将导致FRET丢失。mCGY不能被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2切割，并显示FRET活性。(b条)mCGY或mC2Y转染细胞的代表性FRET图像 μ米*第三种*-丁基过氧化氢(t吨-BuOOH）。(**c（c）**)100倍治疗后FRET疗效分析 μ米t吨-1的BuOOH 小时(d日)0.5处理后FRET效率分析 μM葡萄孢霉素（STS）5 h.数据是三个独立实验的代表，其中每个细胞分析5-10个字段，每个实验量化5-10个细胞。

图5
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2的缺失可保护细胞免受线粒体氧化诱导的细胞死亡。(一)来自新生儿WT的原代皮肤成纤维细胞或*案例2*^−/−如图所示，在玻璃底室中的小鼠接受应激源治疗（STS=0.5 μM葡萄孢霉素6 h；转速=0.5 μM鱼藤酮30 h）用碘化丙啶（PI）和Hoechst染色并在宽视野显微镜上成像；显示了具有代表性的显微照片。(b条)归一化后PI-阳性细胞百分比与总细胞数（Hoechst阳性），然后与未处理细胞的细胞死亡比率。(**c（c）**)来自新生儿WT的原代皮肤成纤维细胞或*案例2*^−/−将小鼠接种在96-well黑色底板中，并按指示使用应激源（STS=0.5 μM葡萄孢霉素15次 h；ETO=100 μ依托泊苷24 h；转速=0.5 μM鱼藤酮30 h；AA=10 μM抗霉素A用于24 h；OLG=23 μ寡霉素15片 h）。治疗后，用PI对细胞进行染色，并通过在平板读取器上测量荧光来量化细胞死亡水平。然后加入洋地黄素溶解所有细胞，再次读取平板。细胞死亡百分比是指洋地黄素处理前后荧光强度的百分比比率。数据表示三个独立实验的值。使用双向方差分析和Bonferroni后验对数据进行分析。

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1. Ho LH、Read SH、Dorstyn L、Lambrusco L、Kumar S。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2是细胞骨架破坏诱导的细胞死亡所必需的。癌基因2008；27: 3393–3404.-公共医学
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[2] Kumar S、Kinoshita M、Noda M、Copeland NG、Jenkins NA。小鼠Nedd2基因诱导细胞凋亡，该基因编码一种蛋白质，类似于秀丽隐杆线虫细胞死亡基因ced-3和哺乳动物IL-1β转化酶的产物。Genes Dev 1994；8: 1613–1626.-公共医学

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[7] 库马尔S。凋亡、DNA损伤反应和肿瘤抑制中的半胱氨酸蛋白酶2：不再是谜了？Nat Rev Cancer 2009年；9: 897–903.-公共医学

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