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.2016年6月;24(6):1050-1061.
doi:10.1038/mt.2016.62。 Epub 2016年3月28日。

下一代随机衣壳显示肽库序列引导筛选腺相关病毒载体的肺靶向性

附属公司

下一代测序引导随机衣壳显示肽库筛选腺相关病毒载体的肺靶向性

雅各布·科尔贝林等。 分子治疗. 2016年6月.

摘要

介导强、持久和组织特异性转基因表达的载体对于安全有效的基因治疗是必需的。在需要系统载体管理的环境中,合适载体的可用性极为有限。在这里,我们提出了一种策略,通过在小鼠模型的循环条件下筛选文库,从腺相关病毒(AAV)上显示的随机肽库中选择对目标组织具有真正特异性的载体。通过下一代测序指导体内筛选,我们能够监测选择动力学,并确定停止筛选过程的正确时间点。不同评分的建立使我们能够确定最特异性富集的AAV衣壳候选。作为概念证明,我们选择了一种衣壳变异体,该变异体能在静脉给药后特异且高效地将基因传递到肺血管内皮细胞。这种在体内选择靶向特定载体的技术方法适用于任何特定的感兴趣组织,因此在转化研究和医学中具有广泛的意义。

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数字

图1
图1
下一代测序(NGS)-指导体内随机X的选择7-肽腺相关病毒(AAV)展示文库用于鉴定高效特异的衣壳靶向肽在小鼠体内静脉注射随机AAV显示肽库。给药后2天(第一轮选择)或6天(第2-5轮选择),从感兴趣的组织中分离出总DNA。通过巢式聚合酶链反应(PCR)扩增含有目标组织中富集颗粒的随机库寡核苷酸的病毒DNA,并将其克隆到库质粒主干中,通过转染AAV产生细胞生成二级AAV显示肽库。二级图书馆用于随后的一轮选择。NGS用于分析PCR-扩增后从小鼠肺部分离的总DNA中选择的寡核苷酸序列。确定了各轮之间20个最常见序列相对丰度变化的中位数(T20中位数)。由于该中值在第四轮和第五轮之间急剧下降,选择过程停止,并对目标器官和非目标器官的PCR-扩增病毒DNA进行分析。对主要衣壳变异体的特异性和功效进行评分,并选择AAV2-ESGHGYF进行进一步验证。
图2
图2
显性衣壳变异体特异性和疗效评分在五轮选择后,对下一代测序分析中占肺部所有读数99%以上的靶向肽进行评分。肽在肺中的相对丰度从左到右依次出现,从PRSADLA(32.74%)到GGDLSRA(0.02%)不等。显示的肽中有三个长度不同。()富集度得分E类针对目标组织描述了在从0到1的范围内从第四轮到第五轮的选择的相对丰度的变化。两轮相对丰度相同的肽产生的值为0.5(虚线),高度富集的序列产生的值接近1。(b条)一般特异性得分GS公司是特定器官的组合S公司评分并描述肽的靶向特异性。肺和所有三个对照器官中相对丰度相同的肽得分为0.125(虚线)。随着特异性的增加,分数增加到1。(c(c))综合得分C类通过乘法生成E类GS公司用理想值1对肽的特异性和疗效进行评分和描述。一种肽的相对丰度从第四轮增加到第五轮,仅为所有三个非靶器官肺部相对丰度的一半,其得分为0.198(虚线)。ESGHGYF是唯一超过这些标准的分析肽。
图3
图3
小鼠静脉注射携带荧光素酶报告基因的AAV载体后的荧光成像. ()静脉注射5×1010gp/小鼠载体,分别显示为嗜肺性选择的肽ESGHGYF、随机对照肽CVGSPCG或野生型AAV2衣壳。从背面(左侧面板)、侧面(中间面板)和正面(右侧面板)对小鼠进行成像。图片显示了每组3只以上动物的典型示例。(b条)注射AAV2-ESGHGYF载体(如)通过测量发射光的不同波长,确定肺部为发光源。(c(c))ESGHGYF注射小鼠的单个器官(如),已测量体外组织移植后立即。(d日)使用ESGHGYF显示载体,通过生物发光成像分析244天内14个时间点的长期转基因表达(n个=2只动物)。上面板:想象中的老鼠,彩虹刻度下部面板:发光值/感兴趣区域。
图4
图4
组织裂解物中荧光素酶活性的测定。载体给药14天后组织裂解物中荧光素酶转基因表达分析。数据显示为条形图(平均值),带有绘制的单个数据点(n个=每组3只动物)。(a)三种载体介导的萤光素酶转基因表达的器官分布,详见图3a.(b)由携带野生型AAV2衣壳(AAV2-WT)、显示对照衣壳的CVGSPCG或显示肺靶向衣壳的ESGHGYF的载体介导的转基因表达在三个器官中的直接比较,其中转基因表达可以通过生物发光成像检测(心脏、肝脏和肺)。
图5
图5
重组腺相关病毒载体的生物分布.通过载体基因组的定量实时PCR测定载体数量。所有实验均在静脉注射5×1010gp/鼠标。数据显示为条形图(平均值),带有绘制的单个数据点(n个=每组3-4只动物)。()载体给药2分钟后,野生型AAV2(左)和AAV2-ESGHGYF(中)在七个分析器官中的分布反映了注射颗粒的组织归巢。从左心室血液中回收的循环微粒数量(右)。(b条)载体给药后14天,AAV2-ESGHGYF或对照载体(野生型AAV2和AAV2-CVGSPCG)传递的基因组分布。(c(c))分别描述包含载体基因组数量最高的三个器官(肝、脾和肺)中的载体基因组数量,并比较用于基因传递的三种衣壳变体。
图6
图6
AAV2-ESGHGYF介导的肺血管内皮细胞特异性基因传递在静脉注射载体1×1011gp/小鼠(AAV2-ESGHGYF或野生型AAV2作为对照)。每个面板b条显示感兴趣组织的代表区域,以不同的放大倍数显示。比例尺尺寸:放大20倍时为100µm;放大40倍时为50µm;和20µm,放大100倍。()用抗转基因产品GFP抗体染色的肺部代表性区域。红色箭头:大肺血管内皮细胞示例;蓝色箭头:肺微血管内皮细胞示例。(b条)用抗GFP抗体染色的肝脏代表性区域。黑色箭头:转基因肝细胞示例(c(c))注射rAAV2-ESGHGYF的小鼠肺代表性区域的连续切片,用抗内皮标记物CD31和抗转基因产物GFP的抗体染色。

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