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.2016年5月;17(5):724-38.
doi:10.15252/embr.201541392。 Epub 2016年3月24日。

氘化酶Usp27x稳定BH3-only蛋白Bim并促进凋亡

附属公司

氘化酶Usp27x稳定BH3-only蛋白Bim并促进凋亡

阿尼姆·韦伯等。 EMBO代表. 2016年5月.

摘要

Bim是BH3-only蛋白亚群的促凋亡Bcl-2家族成员。Bim的表达水平决定了非恶性和肿瘤细胞的凋亡敏感性。在ERK依赖性磷酸化和泛素化后,蛋白酶体降解下调Bim蛋白表达。在这里,我们报告了一种氘激酶Usp27x的鉴定,该酶结合Bim的ERK依赖性磷酸化并能上调其表达水平。Usp27x的过度表达降低ERK依赖的Bim泛素化,稳定磷酸化Bim,并诱导PMA刺激的细胞以及具有组成活性Raf/ERK通路的肿瘤细胞凋亡。内源性Usp27x的缺失增强了致癌Raf的Bim降解活性。Usp27x的过度表达诱导黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的低水平凋亡,并通过抑制ERK信号显著增强这些细胞中诱导的凋亡。最后,Usp27x的缺失减少了EGFR抑制剂治疗的NSCLC细胞的凋亡。因此,Usp27x可以通过其蛋白水解活性触发Bim的去泛素化并提高其水平,抵消ERK活性的抗凋亡作用,从而起到肿瘤抑制剂的作用。

关键词:Bcl-2;比姆;美元27倍;细胞凋亡;氘激酶。

PubMed免责声明

数字

图EV1
图EV1。Usp27x与Bim的交互作用EL公司
  1. 抗‐3xHA‐BIM富集蛋白的概况EL公司小鼠胚胎成纤维细胞纯化线粒体的免疫沉淀(MEF-Bax/Bak‐双敲除细胞)。表达3xHA‐Bim的细胞EL公司用轻氨基酸标记,而对照细胞(只表达未标记的BimEL公司)用重氨基酸标记。γ肌动蛋白(Actg1)作为特异性对照。蛋白质比率根据各自的肽比率计算。计算蛋白质比率时,至少需要两个比率计数。误差线:蛋白质定量变化。误差条表示所有冗余可量化肽信号的变异系数。它被计算为所有肽比率的折叠富集的标准偏差(另见表EV1)。作为Bim相互作用蛋白的Usp27x的鉴定EL公司与早些时候发布的SILAC实验一起确定。Bim和抗凋亡蛋白的富集已经出现在早期报告25中。

  2. 293FT细胞转染未标记Bim的表达结构EL公司以及3xFlag‐Usp27x或3xHA‐Usp27x(所有pMIG‐矢量主干)。在细胞裂解(1%Triton X‐100)和随后的抗-HA免疫沉淀后,在SDS-PAGE上运行未结合部分、输入(各50μg)和IP洗脱液(IP,60%)。使用针对Usp27x(Abgent)的抗体检测到标记有标志或HA的Usp27x。另请参见图1A。类似结果见于n个=3个实验。

  3. Usp27x结合一种不能与抗凋亡Bcl-2蛋白结合的Bim突变。用编码3xFLAG‐Usp27x和3xHA标记Bim的构建物转染293FT细胞EL公司(图1B)或3xHA标记的BimEL公司使用抗-HA树脂从全细胞提取物中免疫沉淀∆∆(BH3结构域中有两个突变的突变,不能结合抗凋亡Bcl-2蛋白50)。如图所示,使用抗HA和抗FLAG抗体检测Bim和Usp27x。控制,pEGFP‐N1矢量。将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Q‐VD‐OPh(QVD)添加到培养物中,以抑制Bim‐诱导的凋亡(另请参见图1)。类似的结果出现在n个=3个实验。

图1
图1。氘激酶Usp27x与Bim相互作用EL公司
  1. 用3xFlag‐Usp27x(pFCMV7.1载体主干)转染293FT细胞,并用构建物驱动未标记Bim的表达EL公司或3xHA‐BimEL公司(均为pMIG载体骨架)。细胞被裂解,3xHA‐BimEL公司用抗HA抗体免疫沉淀。免疫沉淀产物通过Western blotting检测是否存在Bim和FLAG‐Usp27x探针,以及抗Bim或FLAG-肽的抗体。另请参见图EV1B。Western blots显示n个≥3个独立实验。

  2. Usp27x结合一种不能与抗凋亡Bcl-2蛋白结合的Bim突变。用编码3xFLAG‐Usp27x和3xHA标记Bim的构建物转染293FT细胞EL公司(见A,每个2μg)或3xHA标记的BimEL公司使用抗-HA树脂从全细胞提取物中免疫沉淀∆∆(BH3结构域中有两个突变的突变,不能结合抗凋亡Bcl-2蛋白50)。如图所示,使用抗HA和抗FLAG抗体检测Bim和Usp27x;抗凋亡蛋白:Mcl‐1,Bcl‐XL(左),Bcl‐2。将caspase抑制剂Q‐VD‐OPh(QVD)添加到(A)和(B)中所述的培养物中,以抑制Bim诱导的凋亡。Western印迹代表n个=3个独立实验。

  3. Usp27x与内源性Bim相互作用EL公司与催化活性无关。在Tet阻遏物(TetR)的控制下,携带3xFlag‐Usp27x(293FT‐TetR‐3xFlug‐Usp27x)或催化失活突变体3xFlang‐Usp27xC87A的293FT-细胞被多西环素(doxycycline,dox)处理24小时,以诱导Usp27x或Usp27xC 87A的表达。在所有条件下,在Usp27x诱导时添加PMA(诱导Bim泛素化,16.2 nM)和Q‐VD‐OPh(抑制凋亡,10μM,见图3)。在细胞裂解前4小时,在所有条件下添加MG132(为防止Bim降解,40μM)。3xFlag标记的Usp27x或Usp27xC87A使用抗Flag树脂从全细胞裂解物中进行免疫沉淀。与Bim的互动EL公司或β‐TrCP用抗‐Bim或抗‐β‐TrCP抗体通过Western blotting检测。Western blot代表了n个≥3个独立实验。

  4. Usp27x表达不抑制Bim的相互作用EL公司β‐TrCP。用pMIG‐3xHA‐BIM转染293FT‐TetR‐3x Flag‐Usp27x细胞EL公司在同时存在PMA和QVD的情况下。同时,按照指示添加dox(诱导3xFlag‐Usp27x),20 h后用MG132(40μM)处理细胞额外4 h。细胞被裂解,3xHA‐BimEL公司如上所述进行免疫沉淀。作为对照,使用HA基质而不使用裂解物,以排除可能来自固定化抗-HA抗体(珠)的任何非特定信号。Western blots显示n个=2个独立实验。

  5. Usp27x与Bim的绑定EL公司可被甲乙酮抑制剂UO126阻断。293FT‐TetR‐3xFlag‐Usp27x细胞(见C)用dox处理24小时,以诱导Usp27x的表达。在所有条件下,在Usp27x诱导时添加PMA(16.2 nM)和Q‐VD‐OPh(10μM)。作为对照,在添加dox+PMA+QVD之前,用UO126(10μM)预处理细胞30分钟,以阻断PMA刺激的ERK通路。使用抗Flag树脂从全细胞裂解液中免疫沉淀3xFlag标记的Usp27x。与Bim的互动EL公司使用抗Bim抗体进行Western blotting检测。作为对照,在相同条件下与IP一起使用Flag‐matrix(beads),但不添加蛋白裂解物。Western blot代表了n个=4个独立实验(另见图EV2B)。

  6. Usp27x与Bim的绑定EL公司不需要β‐TrCP。293FT‐TetR‐3xFlag‐Usp27x细胞转染对照siRNA(siCo3)或β‐TrCP特异性siRNA。48小时后,用PMA加dox加QVD再刺激细胞24小时。细胞溶解后,使用抗Flag基质和Bim免疫沉淀Flag‐Usp27xEL公司Western blotting鉴定与Usp27x结合的β‐TrCP。印迹代表n个=2个独立实验。

  7. Usp27x专门绑定到BimEL公司.293FT‐TetR‐3xFlag‐Usp27x细胞或特定Bim缺失的293GT‐3x Flag­Usp27 x细胞EL公司用dox、PMA和QVD处理蛋白质,如(C)所示。对细胞进行裂解,并对裂解产物进行反标记免疫沉淀。使用抗FLAG抗体检测3xFlag‐Usp27x。印迹代表n个=3个独立实验。

图EV2
图EV2。Usp27x距离Bim很近
  1. 现场Usp27x与Bim复合物的鉴定EL公司近接连接分析(PLA)分子。按照指示刺激携带dox诱导的3xFlag‐Usp27x(293FT‐3xFlug‐Usp27x)的293FT细胞24小时,固定并渗透。黄色圆点显示内源性Bim和诱导性3xFlag‐Usp27x之间的相互作用点。对于dox+PMA+QVD,覆盖图中显示了两个不同的缩放区域(1、2)。数据代表了n个=2个独立实验。比例尺,50μm。

  2. 3xFlagUsp27x免疫沉淀。使用与(A)中相同的细胞系和条件。在一个样品中,在刺激前30分钟添加UO126。刺激24小时后,细胞被裂解,3xFlag‐Usp27x用抗Flag∙树脂免疫沉淀。使用抗Flag抗体检测Usp27x,使用Bim特异性抗体检测Bim。GAPDH起到了装载控制的作用。数据代表了n个=4个独立实验。

图2
图2。Usp27x的表达稳定了磷酸化形式Bim的表达EL公司并减少Bim在项目管理局刺激293英尺细胞
  1. Usp27x抑制PMA诱导的Bim降解EL公司293FT细胞中。用dox处理293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x或TetR∙3xFlag‐Usp27xC87A细胞以诱导3xFlug‐Usp27x、Usp27xC87A或PMA(诱导Bim)EL公司降解,16.2 nM),或结合dox、PMA和QVD(抑制凋亡,10μM),如图所示,持续24小时(左)或48小时(右)。通过Western blotting分析细胞裂解物。这些斑点代表了n个=4个类似实验。另请参见图EV5B。星号(*)表示野生型3xFlag‐Usp27x的可能修饰形式(例如二聚体、泛素化Usp27x或Usp27x+另一相互作用伙伴的稳定复合物);只有当达到催化活性Usp27x的高表达水平(参见图EV5A,其中Usp27x被转染到293FT细胞中)或如果wt Usp27x-在免疫沉淀过程中富集,才能看到这种形式。双星号(**)表示3xFlag‐Usp27x可能的降解产物。这些形式的Usp27x在每个实验中都没有出现。

  2. 293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x或TetR∙3xFlag‐Usp27xC87A细胞按(A)中处理,使用更高分辨率的条件进行分析。一条很可能对应于磷酸化Bim的带EL公司可以检测到。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。

  3. Usp27x稳定p‐Bim的表达EL公司(Ser69)在Bim‐降解条件下,不降低β‐TrCP水平。293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x按照指示用dox、PMA(16.2 nM)、UO126(10μM)或QVD(10µM)处理24小时,以及磷酸化Bim水平EL公司使用磷酸化Bim(Ser69)特异性抗体通过Western blotting分析丝氨酸69。扫描来自相同的膜和曝光时间。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。

  4. UO126减少Bim磷酸化相关移位EL公司293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x用指定的药物组合处理24小时,并通过蛋白质印迹检测Bim。在其他刺激前30分钟添加UO126。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验(见图EV5D)。

  5. Usp27x的表达减少了Bim的泛素化。293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x细胞转染6His‐泛素(左)或GFP(右)的载体编码。24小时后,用PMA和QVD处理细胞,同时用dox诱导3xFlag‐Usp27x。在额外的20小时后,用MG132(40μM)处理细胞4小时,以阻止泛素化蛋白的蛋白酶体降解。在变性条件下溶解细胞,用镍纯化His‐ubiquitin标记的蛋白质或仅来自GFP表达细胞的蛋白质2+‐NTA亲和层析。泛素化Bim(Bim‐Ubn个)使用抗Bim抗体通过Western blot检测(左)。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验(另一个包括考马斯染色的实验如图EV3E所示)。星号(*)表示非His泛素BimEL公司与Ni无特殊联系2+琼脂糖珠。

图EV3
图EV3。Usp27x裂解双泛素分子
  1. 人类6xHis‐Sumo‐Usp27x从大肠杆菌将不同连接的双泛素分子(K48‐,K63连接的双泛素;每个1μg)与0.1μM Usp2core(*阳性对照,41 kDa)或2.9μM亲和纯化的6xHis‐Sumo‐hUsp27x。考马斯蓝染色显示,Usp27x能够将K48和K63连接的双泛素分子裂解为单泛素。n个=2个单独的实验。

  2. 考马斯染色凝胶,由PureExpress制剂的可溶性部分(4μl)制成,不含模板DNA(仅显示体外PureExpress翻译版大肠杆菌系统)或体外翻译的1xHA‐Usp27x(左凝胶)或1xHA∙Usp27 x及其催化失活突变体1xHA−Usp27-xC87A的翻译产物(右凝胶;Usp27x带标有星号)。反应用于(C)。n个=2。

  3. Usp27x或Usp27xC87A体外使用PureExpress系统翻译(参见B)。反应的四微升可溶部分直接用于蛋白水解活性的测定。作为底物,K48连接的IQF‐di‐UbK48‐6或K63连接的IQR‐di-UbK63‐6(每个200 nM)添加,反应在23°C下培养1–90分钟。作为K48/K63连接的双泛素裂解的读数,测量了去猝灭产生的相对荧光。条形图表示一次实验中重复测量的平均值。

  4. 将4微升可溶性组分(来自A中所示的反应)直接用于活性测定。用1xHA‐Usp27x在23°C下培养6种不同的K48连接IQF‐diUb底物和6种K63连接IQF-diUb衬底(底物#1‐6;每个200 nM)60分钟。作为K48/K63连接的二泛素裂解的读数,使用帝肯M200荧光阅读器测量相对荧光。IQF‐di‐UbK48‐6和IQF∙di­UbK63‐6底物表现出最佳性能,并进一步用于活性分析(见图EV3C)。条形图表示重复测量的实验平均值。

  5. Usp27x表达减少Bim的泛素化。用编码6His‐泛素的载体转染293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x细胞。24小时后,用PMA和QVD处理细胞,同时用dox诱导3xFlag‐Usp27x。在额外的20小时后,用MG132(40μM)处理细胞4小时,以阻止泛素化蛋白的蛋白酶体降解。在变性条件下溶解细胞,并用镍纯化His‐ubiquitin标记的蛋白质2+‐NTA亲和层析。泛素化Bim(Bim‐Ubn个)使用抗Bim抗体通过Western blot检测(左)。星号(*)表示非His泛素Bim,与Ni无特异性结合2+琼脂糖珠(见图2E)。来自相同蛋白质提取物的考马斯染色SDS–PAGE验证了相同的负载量(右)。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验。

图EV4
图EV4。荧光显微镜分析Usp27x和Usp22的亚细胞定位
  1. 携带dox诱导的GFP、GFP-Usp27x或GFP-Usp22的1205Lu黑色素瘤细胞用dox治疗24小时。通过显微镜观察GFP或GFP融合蛋白(绿色)的亚细胞定位。细胞核用Hoechst(蓝色)染色,线粒体用Mitotracker DeepRed FM染色(红色)鉴定。比例尺,20μm。n个= 2. 在GFP‐Usp22的合并图像中,未显示Mitotracker信号。GFP‐Usp27x在HCC827‐GFP‐Usp27x细胞中显示出非常相似的定位(未显示)。

  2. 1205Lu‐GFP‐Usp27x和1205Lu-GFP‐Usp22用dox治疗48小时。通过显微镜观察GFP融合蛋白(绿色)的亚细胞定位。细胞核用Hoechst(蓝色)染色,Bim用内源性Bim(红色)细胞内染色检测。合并图形的放大倍数较高显示在右侧(缩放)。比例尺,20μm。n个= 2. 在所分析的每个视野中都观察到类似的结果。

图3
图3。Usp27x表达致敏293英尺刺激诱导细胞凋亡项目管理局
  1. 293FT‐TetR‐3xFlag‐Usp27x或3xFlug‐Usp27xC87A是一种多克隆衍生物,其中Bim基因座已被CRISPR/Cas9靶向,并且从多克隆系中通过连续稀释获得四个单克隆,按指示处理(PMA 16.2 nM,QVD 10μM)。治疗24小时后,通过活性caspase‐3染色,然后进行流式细胞仪分析,测定细胞凋亡。数据(平均值±SEM)来自n个=14(3xFlag‐Usp27x线和3xFlug‐Usp27xBim2KO多克隆线),n个=5(3xFlag‐Usp27xC87A和3xFlug‐Usp27xBim2KO克隆#14),n个=7(3xFlag‐Usp27xBim2KO克隆#11)或n个=4个(3xFlag‐Usp27xBim2KO克隆#4和#7)独立实验。P(P)‐值(t吨‐测试),以显示统计显著差异。

  2. 将与(A)中相同的细胞(Usp27xC87A突变除外)作为(A)处理,并对活性Bax进行染色。数据(平均值±SEM)来自n个=8(3xFlag‐Usp27x线和3xFlug‐Usp27xBim2KO多克隆线),n个=5(3xFlag‐Usp27xBim2KO克隆#11和#14)或n个=4(3xFlag‐Usp27xBim2KO克隆#4和#7)单独实验。P(P)‐值(t吨‐测试),以显示统计显著差异。不同细胞系的Bim、β‐TrCP和Flag‐Usp27x的表达水平如图EV5E所示。

图EV5
图EV5。Usp27x抑制项目管理局Bim的诱导降解
  1. 在缺乏PMA的情况下,Usp27x的表达不会增加Bim水平。用pCMV‐7.1‐3xFlag‐Usp27x、pCMV‐7.1‐3xFlag‐Usp27xC87A或两种不同的EGFP载体(pEGFP‐C2、pEGFP‐N1)转染293FT细胞。48(左)或72小时(右)后,收集细胞并进行裂解,Bim的蛋白质水平EL公司免疫印迹分析。星号(*)和双星号(**)代表未知来源的Usp27x波段(比较图2A)。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。

  2. 293FT细胞携带dox诱导的3xFlag‐Usp27x(左)或3xFlug‐Usp27xC87A(右),未经治疗或治疗24小时。固定细胞,用抗Bim抗体或同型对照和二级抗体染色,并用流式细胞术进行分析。另请参见图2A和B。n个= 2.

  3. 293FT细胞与dox诱导的GFP或3xFlag‐Usp27x在细胞裂解前按指示处理48小时。Western blotting检测Bim。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验。

  4. MEK抑制剂UO126阻断Bim的磷酸化EL公司.293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x在PMA和QVD存在下用dox治疗24小时。作为对照,相同的细胞在刺激前用UO126(10μM)额外预处理30分钟。显示的是Bim、Flag‐Usp27x和作为负载对照的GAPDH的免疫印迹。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验(另请参见图2B和D)。

  5. 293FT‐3xFlag‐Usp27x细胞与Bim‐敲除细胞系中Bim和Flag­Usp27 x的表达分析。293FT‐TetR‐3xFlag‐Usp27x是一个多克隆Bim‐knockout(Bim2KO)细胞系,该细胞系是使用CRISPR/Cas9和通过连续稀释从多克隆Bim2CO细胞系中获得的四个额外的单克隆(#4、#7、#11、#14)用dox+PMA(16.2 nM)和QVD(10μM)处理24小时。通过免疫印迹分析Bim、Usp27x(Flag)和β-TrCP的表达。有关凋亡测量,请参见图3。星号(*)表示用Bim抗体获得的信号(识别Bim的N末端(脯氨酸25周围)),仅存在于克隆#4和#7中。该带的长度略低于全长BimEL公司右免疫印迹显示第二个实验(n个= 2). 值得注意的是,细胞系之间Bim的相对表达水平在非刺激细胞中是相同的(数据未显示)。

图EV6
图EV6。Usp27x稳定了Bim
  1. Usp27x而非Usp22的过度表达稳定了内源性BimEL公司1205Lu黑色素瘤细胞中。用dox处理携带可诱导构建物的1205Lu细胞,诱导GFP-Usp27x、GFP-Usp27xC87A或3xFlag标记的Usp22 48小时。Western blotting检测Bim。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。

  2. 按照指示处理具有诱导型构建体的1205Lu细胞以诱导GFP或GFP-Usp27x。MEK抑制剂UO126用于阻断ERK活性。值得注意的是,BimEL公司当细胞被UO126处理时,蛋白质转移到较低的分子量,可能是去磷酸化的作用。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。

  3. 如图所示,对携带dox诱导的HA‐BRAF‐V600E的Caco2结肠癌细胞进行治疗。通过Western blotting检测ERK磷酸化。注意诱导HA‐BRAF‐V600E后Bim蛋白的丢失(n个= 2).

  4. 3xFlagUsp27x抑制BRAF‐V600E诱导后的Bim损失。母体Caco2‐HA‐BRAF V600E细胞或稳定表达组成型3xFlag‐Usp27x的相同细胞用dox处理3(左)或96(右)小时以诱导BRAF‐V600E(两个单独的实验)。用Western blotting法测定Bim水平。对于每种情况,BimEL公司根据所示的免疫印迹定量并归一化为微管蛋白信号。Bim百分比EL公司给出相对于设置为100%的起点的表达式。在中获得了类似的结果n个=3个不同诱导时间的单独实验。另请参见图4D。

  5. Usp27x特异性siRNAs的验证。用靶向人类Usp27x的siRNA或对照siRNA转染293FT细胞。通过使用一个针对Usp27x的siRNA(#861)或三个靶向Usp27xsiRNA的组合(#495,#498,#861。24小时后,用构建物转染细胞,以驱动人类Usp27x的表达和IRES中GFP的表达。24小时后通过Western blotting检测到Usp27x和GFP(n个= 2). 三种siRNA的组合用于随后的击倒实验(见图5A)。

  6. 293FT和1205Lu之间Bim表达水平的比较。从293FT细胞和1205Lu黑色素瘤细胞获得的全细胞裂解物的Western blot。对于这两种细胞系,50μg蛋白质通过SDS-PAGE进行分析,Bim通过抗Bim抗体进行鉴定。Tubulin用作加载控制。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。

  7. 293FT‐Usp27xKO的验证(克隆2/10)。排序结果(n个=1)表示胸腺嘧啶(T)插入核苷酸(nt)391(箭头)。这种插入导致在aa 130之后添加14个不同的氨基酸,然后是终止密码子。因此,该克隆表达了一个截断版本的Usp27x(wt有438 aa),删除了部分催化活性/三联体(涉及aa C87A(亲核),以及Usp27x28中预测的位点H380(质子受体)和aa D396/D397)。

图4
图4。Usp27x而非Usp22可以通过Raf‐ERK公司通路
  1. 基于人类黑色素瘤细胞系1205Lu(BRAF‐V600E‐阳性)的细胞系在多西环素(doxycycline,dox)诱导启动子的控制下携带GFP‐Usp27x、GFP-Usp27xC87A或GFP-Usp22。用dox诱导GFP-Usp27x、GFP-Usp27xC87A或GFP‐Usp22 24或48小时。通过Western blotting测定Bim水平。两块左侧面板来自相同的膜和曝光时间。在中获得了类似的结果n个=4个单独的实验(左)和n个=3个实验(右)。另请参见图EV6A,其中3xFlag‐Usp22也显示无法增加Bim级别。使用抗GFP的抗体检测GFP‐Usp27x、GFP-Usp27xC87A或GFP-Usp22的表达。

  2. 从BRAF‐V600E阳性的人类黑色素瘤细胞系WM1158中获得的细胞系携带可诱导的GFP‐Usp27x。诱导了GFP‐Usp27x,并检测到Bim,如(A)所示。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验。使用抗GFP抗体检测GFP‐Usp27x的表达。

  3. NSCLC细胞系HCC827的衍生物(表达组成活性EGFR)仅表达Tet阻遏物(TetR)或携带GFP-Usp27x或GFP-Usp27xC87A。用dox处理细胞72小时。通过Western blotting检测Bim。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。使用抗GFP的抗体检测GFP‐Usp27x或GFP-Usp27xC87A的表达。

  4. 携带dox诱导的HA‐BRAF‐V600E 37(左两车道)的Caco2细胞或稳定表达3xFlag‐Usp27x的相同细胞用dox处理48小时,以诱导HA‐BRAF‐V600 E的表达。Western blotting检测Bim。Bim的金额EL公司使用设置为100%的未诱导对照细胞的表达水平(针对每种条件标准化为微管蛋白信号)从所示的免疫印迹中定量。在中获得了类似的结果n个=3个不同诱导时间的单独实验。另请参见图EV6D。

图5
图5。内源性Usp27x稳定Caco2和293中的Bim英尺细胞
  1. 内源性Usp27x的丢失增强了Bim的不稳定性EL公司响应BRAF‐V600E。携带可诱导HA‐BRAF‐V600E的Caco2细胞转染对照siRNA(siCo3)或针对Usp27x的siRNA(三种靶向Usp27xmRNA的siRNA的组合)24小时,然后用dox表达BRAF−V600E 2小时(左)或4小时(右)。比姆EL公司经Western blotting检测。n个=诱导3小时后再进行2次实验(未显示,siRNA功效见图EV6E)。

  2. 缺乏Usp27x的293FT细胞显示Bim的不稳定性增强EL公司响应PMA。用PMA(16.2 nM)处理293FT wt细胞或293FT-Usp27xKO(克隆2/10,使用CRISPR/Cas9生成)16或24小时以诱导BimEL公司退化。蛋白质印迹显示n个=3个独立执行的实验(在另一个实验中获得了类似的结果,未显示)。通过DNA序列分析验证Usp27xKO细胞系,见图EV6G。

图6
图6。Usp27x稳定了ERK公司‐293年的降解途径英尺细胞、1205Lu黑色素瘤和肝癌827非小细胞肺癌细胞
  1. 用PMA(16.2 nM)加QVD(10μM)处理293FT‐TetR‐3xFlagUsp27x细胞,同时用dox诱导3xFlug‐Usp27x细胞24小时,然后添加环己酰亚胺(CHX)。在指定的时间点采集细胞,并检测Bim水平EL公司通过Western blotting测定。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验。所示的切割膜来自一个具有相同暴露时间的膜。对于每种情况,BimEL公司水平被量化并标准化为微管蛋白信号。Bim百分比EL公司给出了相对于起点的表达式。

  2. 用dox处理携带dox诱导的GFP‐Usp27x的1205Lu黑色素瘤细胞24小时。然后添加环己酰亚胺(CHX,1μg/ml)。在指定的时间点采集细胞,并检测Bim水平EL公司通过Western blotting测定。用抗GFP抗体检测GFP‐Usp27x。在中获得了类似的结果n个=3个单独的实验。第二个实验如右图所示,也包括携带dox诱导的GFP‐Usp27xC87A突变体的1205Lu黑色素瘤。对于每种情况,BimEL公司水平被量化并标准化为微管蛋白信号。Bim百分比EL公司给出相对于设置为100%的起点的表达式。非诱导Usp27x/C87A细胞(‐dox)的起点如实验一和实验二(‐dox,‐CHX)的车道1所示。所示的切割膜来自一个具有相同暴露时间的膜。WM1158黑色素瘤细胞也获得了相同的结果(数据未显示)。

  3. 如图所示,用dox诱导HCC827细胞表达GFP‐Usp27x。24小时后,在指定的时间内添加环己酰亚胺(CHX,1μg/ml)。比姆EL公司Western blotting检测到在指定的治疗时间后。对于每种情况,BimEL公司水平被量化并标准化为微管蛋白信号。Bim百分比EL公司给出了相对于起点的表达式。在中获得了类似的结果n个=2个单独的实验。显示的切割膜来自具有相同暴露时间的一个膜。

图7
图7。Usp27x使1205Lu黑色素瘤和肝癌827非小细胞肺癌通过抑制Raf‐ERK公司通路
  1. 如图所示,用多西环素(doxycycline,dox)治疗1205Lu黑色素瘤细胞,这些细胞携带dox诱导的GFP、GFP-Usp27x或GFP-Usp27xC87A。48小时后,再添加UO126(10μM)48小时。通过活性半胱天冬酶-3染色,然后进行流式细胞术分析,测定细胞凋亡。数据(平均值±SEM)来自n个=3(GFP)或来自n个≥6个单独的实验(GFP‐Usp27x和GFP‐的Usp27xC87A)。P(P)‐值(t吨‐测试),以显示统计显著差异。不适用。,P(P)> 0.05. 添加QVD抑制细胞活性caspase‐3阳性染色(未显示)。活性Bax的染色如图EV7B所示。

  2. 携带dox诱导的GFP-Usp27xC87A、GFP-Usp27x的HCC827非小细胞肺癌细胞或从这些GFP-Usp27x细胞建立的两个单独的细胞系,其中Bim位点已使用CRISPR/Cas9(Bim‐KO)靶向缺失,如图所示,用dox和EGFR抑制剂吉非替尼(10μM)联合治疗。治疗72小时后,通过活性caspase‐3染色,然后进行流式细胞仪分析,测定细胞凋亡。数据(平均值±SEM)来自n个≥15(母体GFP‐Usp27x线)或来自n个≥5(对于Bim1KO)或来自n个≥6(对于Bim2KO)或n个=4(对于GFP‐Usp27xC87A)单独实验。P(P)‐值(t吨‐测试),以显示统计显著差异。同样,添加QVD抑制细胞活性caspase‐3阳性染色(未显示)。插图显示了Bim‐淘汰效率(n个= 2).

图EV7
图EV7。Usp27x通过抑制Raf‐ERK公司通路
  1. 如图所示,对携带dox诱导的GFP‐Usp27x的1205Lu黑色素瘤细胞和使用CRISPR/Cas9靶向Bim的相同细胞(1205Lu-GFP‐Usp27x/Bim2KO)进行dox治疗。48小时后,再添加UO126(10μM)48小时。通过活性半胱天冬酶-3染色,然后进行流式细胞术分析,测定细胞凋亡。所有数据(平均值±SEM)来自n个=5个单独的实验。P(P)‐值(t吨‐测试),以显示统计显著差异。QVD的加入阻止了活性caspase‐3染色的出现(未显示)。插图显示Bim在1205Lu‐GFP‐Usp27x黑色素瘤细胞中的敲除效率(n个= 2).

  2. 表达GFP-Usp27x或GFP-Usp27xC87A的1205Lu黑色素瘤细胞按(A)中的方法处理,使用仅识别Bax活化形式的构象特异性抗体(6A7克隆)通过FACS测量具有活性Bax的细胞百分比。所有数据(平均值±SEM)来自n个=5(GFP‐Usp27x)或n个=3(GFP‐Usp27xC87A)单独实验。P(P)‐值(t吨‐测试),以显示统计显著差异。

  3. 如图所示,在1205Lu黑色素瘤细胞中诱导了Dox诱导的GFP-Usp27x或GFP-Usp27xC87A。48 h后,按照指示用vemurafenib处理细胞24 h。通过活性caspase‐3染色和流式细胞术测定细胞凋亡。条形图显示来自n个=2个独立进行的实验。

图8
图8。Usp27x缺失可减少吉非替尼诱导的细胞凋亡肝癌827非小细胞肺癌细胞
  1. A、 B类

    用吉非替尼(10μM)处理HCC827 NSCLC细胞和从这些细胞建立的两个单独的多克隆系,其中Usp27x基因座已通过CRISPR/Cas9和两个不同的针对Usp27x的导向RNA(Usp27xKO-1和Usp27xKO-4)靶向删除,处理48小时。通过活性caspase‐3(A)染色来测量细胞凋亡或通过染色活性Bax(B;抗体:6A7克隆),然后进行流式细胞术分析。所示数据(平均值±SEM)来自n个=4个单独的实验。P(P)‐值(t吨‐测试),以显示统计显著差异。

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