Oxidized dNTPs and the OGG1 and MUTYH DNA glycosylases combine to induce CAG/CTG repeat instability

doi:10.1093/nar/gkw170

.2016年6月20日；44(11):5190-203.

doi:10.1093/nar/gkw170。 Epub 2016年3月14日。

氧化dNTPs与OGG1和MUTYH DNA糖基化酶联合诱导CAG/CTG重复不稳定性

皮亚拉·西利¹, 伊莱妮亚·文图拉², 安娜·米诺普里奥², Ettore Meccia公司², 阿尔贝托·马蒂尔³, 塞缪尔·威尔逊⁴, 玛格丽塔·比格纳米⁵, 菲洛梅娜·马泽伊⁶

附属公司

¹意大利罗马高等卫生研究所环境与初级预防司，邮编：00161，意大利罗马特雷大学科学系，邮编：0154，意大利罗马。
²意大利罗马市环境与初级预防局，邮编00161。
³药物安全与评估部，意大利罗马，邮编00161。
⁴美国北卡罗来纳州三角研究园国立卫生研究院国家环境健康科学研究所基因组完整性和结构生物学实验室，邮编27709。
⁵环境和初级预防部，意大利罗马，00161Margherita.bignami@gmail.com。
⁶意大利罗马市环境与初级预防局，邮编00161filomena.mazzei@iss.it。

PMID： 26980281
预防性维修识别码：项目经理4914090
内政部： 10.1093/nar/gkw170

氧化dNTPs与OGG1和MUTYH DNA糖基化酶联合诱导CAG/CTG重复不稳定性

皮耶拉·西里等。核酸研究. 2016.

.2016年6月20日；44(11):5190-203.

doi:10.1093/nar/gkw170。 Epub 2016年3月14日。

作者

附属公司

¹意大利罗马高等卫生研究所环境与初级预防司，邮编：00161，意大利罗马特雷大学科学系，邮编：0154，意大利罗马。
²意大利罗马市环境与初级预防局，邮编00161。
³药物安全与评估部，意大利罗马，邮编00161。
⁴基因组完整性和结构生物学实验室，美国国家环境卫生科学研究所，美国国立卫生研究院，三角研究园，北卡罗来纳州27709。
⁵意大利罗马市环境与初级预防局，邮编00161Margherita.bignami@gmail.com。
⁶意大利罗马市环境与初级预防局，邮编00161filomena.mazzei@iss.it。

PMID： 26980281
预防性维修识别码：项目经理4914090
内政部： 10.1093/nar/gkw170

摘要

DNA三核苷酸重复序列（TNR）扩增是包括亨廷顿病（HD）在内的几种神经退行性疾病的基础。氧化DNA碱基的积累及其通过碱基切除修复（BER）的低效处理是导致TNR扩增的因素之一。在本研究中，我们检测了dNTP池中嘌呤dNTP的氧化是否提供了促进TNR扩增的DNA损伤来源。我们证明，在TNR序列中8-氧鸟嘌呤（8-oxodG）的BER过程中，DNA聚合酶β（POLβ）可以结合8-oxodGMP，形成8-oxodG:C和8-oxodG-A错位。OGG1和MUTYH DNA糖基化酶对其进行处理，在相对的DNA链上产生密集的切口，允许TNR扩增。在HD模型R6/2小鼠中的证据表明，这些DNA糖苷酶存在于受神经退行性变影响的大脑区域。与普遍存在的氧化应激一致，相同的脑区DNA 8-oxodG水平增加，p53诱导的核糖核苷酸还原酶表达增加。我们的体外和体内数据支持一个模型，即氧化的dNTPs池和异常的BER处理有助于非复制细胞中TNR的扩增。

©作者2016。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图1。**
在TNR序列中纳入8-oxodGMP和2-OH-dAMP。(A类和B)结合dGMP和8-oxodGMP对胞嘧啶。(A类)显示了底漆/模板序列和代表性凝胶。将引物/模板底物（160 nM）（S1/T1）与POLβ孵育，并在37°C下增加8-oxodGTP或dGTP浓度1 h（分别为0-30μM和0-3μM）。M是不含酶的DNA底物。用20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在500V下对反应产物进行2.5小时的分离。通过台风扫描仪的荧光发射对谱带进行可视化，并通过以下方法对谱带强度进行分析：*图像J*软件。(B)绘制为添加dNTP函数的合并dNMP百分比。利用Kaleidiagraph软件对数据进行拟合，以评估动力学参数。(C类和D类)8-oxodGMP和dTMP对腺嘌呤的结合。引物/模板序列为S2/T1（补充表S1）。实验条件和分析如上所述。8-oxodGTP和dTTP的浓度范围分别为0–2μM和0–1μM。(E类–F类)在CAG/CTG重复序列中合并2-OH-dAMP和dAMP。(E类)底漆/模板顺序为S3/T2（补充表S1）；(F类)在添加2-OH-dATP（通道2）、dGTP和2-OH-dTP（通道3）后，在没有dNTP（通道1）的情况下，在10μl反应缓冲液中用POLβ（0.1U）培养引物/模板双重物（160 nM）；2-OH-dATP、dGTP和dCTP（车道4）、dATP（车道5）；dATP和dGTP（车道6）、dATP、dGTP和dCTP（车道7）。所有三磷酸核苷酸的最终浓度为10μM。通过15%变性PAGE分离反应产物，并如前所述进行图像采集和分析。

**图2。**
通过POLβ合并和扩展8-oxodGMP。使用引物/模板（160nM）（补充表S1，S3/T2面板A；S1/T1面板B）。两种底物均与POLβ（0.1 U）和8-oxodGTP或dGTP及其他dNTP（各50μM最终浓度）孵育。(A类)车道1，底漆；车道2，8-oxodGTP；3号车道，作为2号车道加上dCTP；车道4，作为车道3加上dATP；车道5，作为车道4加上dTTP；车道6，底漆+dGTP；泳道7，作为泳道6加上dCTP；8号车道为7号车道加上dATP；9号车道，8号车道加上dTTP。(B)车道1，底漆；车道2，底漆加8-oxodGTP；3号车道，作为2号车道加上dCTP；车道4为车道3加上dTTP；车道5，作为车道4加上dATP；车道6，底漆+dGTP；7号车道，作为6号车道加上dCTP；8号车道为6号车道，加上dTTP和dATP。(C类)通过对补充表S1中分别表示为S1、S4和T1的22、77和100个碱基的三个寡聚体进行退火，构建DNA底物（160 nM），以产生含有CTG/CAG重复序列的预制刻痕双链。通过在37°C下将底物（通道3）与POLβ（0.1 U）孵育1小时，获得dGTP和8-oxodGTP（通道1和4）的结合以及延伸率（通道2和5）。

**图3。**
通过纯化蛋白和AGS细胞提取物进行TNR扩增。用OGG1和APE1酶预先培养一个100 bp的双链，5′端6-FAM标记，包含20个CAG重复序列和一个8-oxodG（G*）（补充表S1中的S5和T2低聚物）（面板A类–C类，车道1），然后在下述条件下进行进一步处理。反应产物用15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。M是100 nt、109 nt和115 nt标记的组合。(A类)POLβ（车道2）和含有POLβ和LIG1（车道3-4）的重复样品运行。窗格底部显示了车道2中RI的密度剖面我A.凝胶右侧显示了100–115 nt区域中通道2和3的密度扫描特写图。(B)AGS细胞提取物（30μg）（车道2）；单独补充LIG1（泳道3），或补充POLβ（泳道4）和POLβ加LIG1（泳道5）的AGS提取物。第2和第4道RI的密度剖面位于面板B的底部。凝胶右侧显示了100-115nt区域第3和第5道RI密度扫描。(C类)在dGTP（50μM）（通道2）、氧化dGTP的存在下（通道4）和其他dNTP（50µM）补充POLβ的AGS细胞提取物；LIG1补充位于第3和第5车道。凝胶底部报告了通道2和通道4中RI的密度剖面，右边是100-115nt区域的密度剖面。

**图4。**
包含多个氧化损伤和8-oxodG的TNR重复序列中的LP BER：修复。使用100 bp的双链体，在5′端用6-FAM（160 nM）标记，包含20个不间断的CAG重复序列和两个8-oxodG碱基（标记为G*）。为了获得不同的病灶分离，8-oxodG位于(A类)第1和第4次重复或(B)第1和第9次重复。低聚物的完整序列为S7和S8（G*链）和T2（互补链）（补充表S1）。(A类和B)未经处理的样品（泳道1）；与OGG1和APE1孵育的样品（通道2）；用AGS提取物（3道）和补充POLβ的AGS提取物培养底物后获得的产品（4道）。反应产物用15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。(C类)含有8-oxodG:C和8-oxodG的36米DNA底物：CTG/CAG重复上下文中的错误（补充表S1中的S9和S10低聚物）。含有氧化损伤的顶链用德克萨斯红染料标记5′端；底部链用6-FAM标记5′端。红色和绿色箭头分别表示OGG1和MUTYH酶的假定切除位点。(D类)DNA底物（10 nM）在37°C下与浓度增加的纯化OGG1（0–20 nM）反应30分钟(E类)DNA底物（10 nM）面积**c（c）**在37°C下增加纯化MUTYH（0–20 nM）浓度30分钟(F类)POLβ定向间隙填充。先前用MUTYH和APE1处理过的DNA双链体（10 nM）在37°C下与不断增加的POLβ（1-3道分别为0.25、0.75和1 U）和50μM dATP、dCTP和dGTP孵育30分钟。反应产物用20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。星号和箭头分别表示全长低聚物和反应产物的位置。(**G公司**)含有单个8-oxoG的100 bp底物：通过退火S11和T4低聚物获得的错配（补充表S1）；绿色箭头表示MUTYH的潜在切除部位。(**H（H）**)用MUTYH和APE1（通道1）预先培养的DNA底物与POLβ（通道2和3重复运行）和POLβ+LIG1（通道4）在50μM dNTPs存在下培养。M是不同大小标记的混合物。

**图5。**
WT和R6/2小鼠脑区OGG1和MUTYH蛋白水平的Western blot分析。用Western blot法分析制备的全提取物中OGG1和MUTYH蛋白(A类)纹状体(B)运动皮层(C类)8周龄WT和R6/2小鼠的小脑。(D类)12周龄WT和R6/2小鼠运动皮层提取物中相同基因的表达。1–2和3–4通道中的数据分别来自2只WT和2只R6/2小鼠。这些图表显示了蛋白质印迹的定量，即DNA修复蛋白水平与微管蛋白（TUB）的比率。这些数据来自4只WT和4只R6/2小鼠的独立提取物。WT小鼠（WT，开放条）；R6/2小鼠（黑条）。

**图6。**
野生型和R6/2小鼠脑区8-oxodG的稳定水平和p53R2蛋白的表达。处死WT组（n=10）和R6/2组小鼠（n=100），并通过HPLC-EC测定从指定脑区制备的基因组DNA中8-oxo-dG的水平。DNA 8-oxodG水平(A类)纹状体和(B)12周龄WT（WT，开放条形）和R6/2小鼠（灰色ba第页). 数据为平均值±SE。星号表示学生的t吨-测试(**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.02). 制备的全提取物中p53R2的Western blot分析(C类)纹状体(D类)运动皮层和(E类)WT和R6/2小鼠小脑。1–2和3–4通道中的数据分别来自2只WT和2只R6/2小鼠。这些图表显示了蛋白质印迹的定量，即DNA修复蛋白水平与TUB的比率。误差线表示3-4次独立测定的平均值±SD。

**图7。**
TNR扩张过程中的新贡献者。在OGG1和APE1介导的顶部链中8-oxodG位点的初始切割事件（红色，步骤1）后，POL通过LP BER驱动修复合成。长皮瓣可能最终折叠成稳定的二级结构（步骤2）。FEN1根据皮瓣的构象进行错误的切除可能会使发夹具有无法连接的dRP末端（步骤3）。通过POLβ去除dRP允许LIG1结扎（步骤4）。如果8-oxodGTP存在于dNTPs池中，8-oxodGMP可以在互补链中与A相对合并，从而形成MUTYH的底物（步骤5）。底部钢绞线（蓝色）上的MUTYH活性允许启动新的修复事件，以及该侧的延伸过程（步骤6）。钢绞线的重新排列将导致TNR膨胀（步骤7）。新合成的区域用完整的矩形表示。建议的模型已根据参考文献进行了修改。(12,16,40).

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