The Small C-terminal Domain Phosphatase 1 Inhibits Cancer Cell Migration and Invasion by Dephosphorylating Ser(P)68-Twist1 to Accelerate Twist1 Protein Degradation

doi:10.1074/jbc.M116.721795

.2016年5月27日；291(22):11518-28.

doi:10.1074/jbc。M116.721795。 Epub 2016年3月14日。

小C末端结构域磷酸酶1通过去磷酸化Ser（P）68-Twist1加速Twist1蛋白降解抑制癌细胞迁移和侵袭

孙童¹, 傅俊江², 陶申¹, 夏琳^三, 兰辽¹, 新华丰⁴, 徐建明⁵

附属公司

¹来自分子和细胞生物学系。
²来自中国四川省泸州市西南医科大学肿瘤医学研究所分子与细胞生物学系、临床前医学研究中心和基础医学院，邮编：646000。
^三德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院迈克尔·E·德巴基外科，邮编77030。
⁴来自分子和细胞生物学系，Michael E.DeBakey外科，贝勒医学院，休斯顿，得克萨斯州77030，浙江大学生命科学研究所和细胞信号网络创新中心，杭州，浙江310058，中国。
⁵来自中国四川省泸州市西南医科大学肿瘤医学研究所分子与细胞生物学系、临床前医学研究中心和基础医学院，邮编：646000jxu@bcm.edu。

PMID： 26975371
预防性维修识别码：项目经理4882423
内政部： 10.1074/jbc。M116.721795号

小C末端结构域磷酸酶1通过去磷酸化Ser（P）68-Twist1加速Twist1蛋白降解抑制癌细胞迁移和侵袭

孙彤（Tong Sun）等。生物化学杂志. 2016.

.2016年5月27日；291(22):11518-28.

doi:10.1074/jbc。M116.721795。 Epub 2016年3月14日。

作者

孙彤（Tong Sun）¹, 傅俊江², 陶申¹, 夏琳^三, 兰辽¹, 新华丰⁴, 徐建明⁵

附属公司

¹来自分子和细胞生物学系。
²来自西南医科大学肿瘤医学研究所分子与细胞生物学系、临床前医学研究中心和基础医学院，四川泸州646000，和。
^三德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院迈克尔·E·德巴基外科，邮编77030。
⁴来自德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院分子与细胞生物学系、迈克尔·E·德巴基外科、浙江大学生命科学研究所和细胞信号网络创新中心，邮编：310058。
⁵来自中国四川省泸州市西南医科大学肿瘤医学研究所分子与细胞生物学系、临床前医学研究中心和基础医学院，邮编：646000jxu@bcm.edu。

PMID： 26975371
预防性维修识别码：项目经理4882423
内政部： 10.1074/jbc。M116.721795号

摘要

Twist1是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，能强烈促进癌细胞的上皮-间充质转化、迁移、侵袭和转移。丝氨酸68（Ser（P）（68）-Twist1）上的MAPK-磷酸化Twist1具有显著增强的稳定性和促进癌细胞侵袭和转移的功能。然而，去磷酸化Ser（P）（68）-Twist1并破坏Twist1稳定性的磷酸酶尚未被鉴定和表征。在本研究中，我们在体外共表达Twist1的HEK293T细胞中筛选了丝氨酸/苏氨酸磷酸酶cDNA表达文库。我们发现，在无细胞反应和活细胞中，小C末端结构域磷酸酶1（SCP1）特异性地去磷酸化Ser（P）（68）-Twist1。SCP1使用其氨基酸残基43-63与Twist1的N末端相互作用。细胞中SCP1表达的增加降低了Ser（P）（68）-Twist1和总Twist1蛋白，而SCP1的敲除则增加了Ser。此外，在几种癌细胞系中，SCP1的水平与Twist1蛋白水平呈负相关。SCP1-dephosphorylated Twist1通过泛素蛋白酶体途径快速降解。重要的是，内源性或外源性表达Twist1的乳腺癌细胞中SCP1表达的增加在很大程度上抑制了Twist1-诱导的上皮-间充质转化表型以及这些细胞的迁移和侵袭能力。这些结果表明，SCP1是反调节MAPK介导的Ser（68）-Twist1磷酸化的磷酸酶。因此，增加SCP1的表达和活性可能是消除Twist1在癌细胞中有害作用的有效策略。

关键词：乳腺癌；细胞信号；上皮-间充质转化；基因调控；分子细胞生物学；蛋白质相互作用；蛋白磷酸酶。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**SCP1作为去磷酸化Ser（P）的磷酸酶的鉴定⁶⁸-在单元格中扭转1。** A类筛选磷酸酶表达文库。如图所示，HEK293T细胞与空载体Twist1-F和一种FLAG标记的磷酸酶共同转染（仅显示部分筛选数据）。每条车道上装载了40微克蛋白质。使用FLAG抗体通过蛋白质印迹分析Twist1-F和FLAG标记的磷酸酶的表达水平。序号（P）⁶⁸-扭转1(*P-扭转1*)和总扭曲1(*扭转1*)通过使用Ser（P）的蛋白质印迹进行分析⁶⁸-Twist1和Twist-1抗体。指示了用密度计测量的相对带强度。Tubulin和GAPDH用作装载控制。B类，SCP1去磷酸化Ser（P）⁶⁸-以剂量依赖的方式扭转1。如图所示，HEK293T细胞与空载体（−）、Twist1-F、HA-Smad4和增加的F-SCP1共同转染。Smad4作为阴性对照。序号（P）⁶⁸-Twist1和总Twistl通过其特定抗体进行测量。显示了相对带强度。用FLAG抗体分析F-SCP1，由于分子量相似，FLAG抗体与Twist1-F部分重叠。C类SCP1的过度表达降低了Ser（P）的比率⁶⁸-扭曲1到总扭曲1。用Twist1-F和增加数量的F-SCP1质粒转染HEK293T细胞。总Twist1的类似数量(*中央面板*)从单个样本中加载以分析Ser（P）⁶⁸-扭转1(*顶部面板*). 用SCP1抗体检测F-SCP1和内源性SCP1(*底部面板*). 显示了相对带强度。D类，SCP1去磷酸化内源性Ser（P）⁶⁸-用空载体或F-SCP1质粒转染MDA-MB-435和4T1细胞。转染细胞用Ser（P）进行Western blotting分析⁶⁸-Twist1、Twist2和FLAG抗体。输入被调整到总扭曲1的类似水平(*中央面板*). 显示了相对带强度。*Ctrl键*，控制。

**图2。**
**SCP1去磷酸化Ser（P）⁶⁸-在无电池条件下扭转1。** A类将从HEK293细胞纯化的Twist1-F蛋白与纯化的GST-SCP1或GST-dnSCP1混合，并在磷酸酶缓冲液中培养。B类，序列号（P）⁶⁸-Twist1、总Twist1、GST-SCP1和GST-dnSCP1用它们的特异性抗体通过蛋白质印迹进行分析。每条车道上装载了40微克蛋白质。C类用密度计测量Western blot的条带强度，并以Ser（P）的相对比值表示⁶⁸-扭曲1到扭曲1。实验重复了三次，第页<0.0001（学生）t吨测试。

**图3。**
**SCP1与Twist 1交互。** A类，联合IP。用1μg FLAG-SCP1质粒和1μg HA-Twist1质粒共同转染HEK293T细胞。用HA抗体或IgG进行Co-IP，然后进行免疫印迹(*IB公司*)如所示具有SCP1和Twist1抗体。B类内源性Twist1和SCP1的co-IP分析。从4T1细胞制备含有内源性Twist1和SCP1的细胞裂解物。Co-IP通过Twist 1进行(*顶部面板*)或SCP1(*底部面板*)抗体。IgG用作阴性对照。如图所示，使用Twist1和SCP1抗体进行蛋白质印迹分析。C类GST下拉分析。将谷胱甘肽-Sepharose 4B珠结合GST、GST-SCP1和GST-dnSCP1蛋白混合，并与来自HEK293细胞的纯化Twist1-F蛋白孵育。在SDS-PAGE还原缓冲液中通过煮沸清洗和洗脱珠子。用Twist1抗体通过Western blotting分析洗脱的蛋白质(顶部). 通过Ponceau S染色观察输入蛋白(底部).

**图4。**
**SCP1的氨基酸43-63区域负责与Twist1的N末端相互作用。** A类使用谷胱甘肽-Sepharose 4B珠从细菌中纯化GST标记的全长SCP1和9个SCP1片段。B类，Twist1-F蛋白在HEK293细胞中表达，并按Fu所述进行纯化*等人。*(12). 将等量纯化的Twist1-F蛋白与携带10μg GST（阴性对照）、GST标记的全长SCP1或GST标记的SCP1片段之一的珠一起孵育。使用Twist1抗体分析共沉淀蛋白。如图所示，使用GST或Twist1抗体分析输入蛋白。*Ctrl键*，控制；*IB公司*，免疫印迹。C类和D类GST下拉分析。在细菌中产生Twist1-F及其带有C末端FLAG标签的N末端、培养基和C末端片段。将细菌提取物与携带GST、GST-SCP1-2或GST-SCP2-4（参考A类SCP1片段命名）。用FLAG抗体通过Western blotting分析共沉淀蛋白。如图所示，使用FLAG或GST抗体通过Western blotting分析输入蛋白。*bHLH、，*基本螺旋-环-螺旋。

**图5。**
**SCP1介导的Ser（P）去磷酸化⁶⁸-Twist1加速了Twistl降级。** A类，HEK293细胞（10⁵)用1μg HA-SCP1、HA-dnSCP1或空载体转染DOX诱导的Twist1表达。48小时后，用或不用DOX处理细胞6小时。进行蛋白质印迹分析显示的蛋白质。*Ctrl键*，控制。B类，MDA-MB-436细胞（10⁵)用1μg空质粒或HA-SCP1质粒转染48 h，然后采集细胞进行所示蛋白的Western blotting分析。C类SCP1、Ser（P）的Western blotting分析⁶⁸-表达非靶向shRNA（shCtrl）和SCP1 mRNA降解shRNAs（shSCP1-1和shSCP1-2）的MDA-MB-436细胞系中的Twist1和Twist2蛋白。D类SCP1 mRNA的实时PCR分析(*顶部面板*)和Western印迹分析(*底部面板*)SCP1，序列号（P）⁶⁸-表达shCtrl、shSCP1-1或shSCP1-2 shRNAs的石川细胞中的Twist1和Twist1。E类用环己酰亚胺处理表达shCtrl、shSCP1-1或shSCP1-2 shRNA的石川细胞(*瑞士法郎*)在指定的时间段内。使用Twist1和微管蛋白抗体通过Western blotting分析细胞裂解产物(*顶部面板*). 从三个实验中用密度计测量了谱带强度。将各组的相对带强度归一化为时间零点的带强度(*底部面板*).F类，细胞系中内源性SCP1和Twist1的蛋白质印迹分析表明，它们之间存在负相关关系。从三个实验中获得平均带强度，并将其归一化为每个实验中β-actin的带强度。R值是使用GraphPad Prism软件从线性回归分析中获得的。

**图6。**
**SCP1促进Twist1泛素化。** A类用空载体（−）或HA-SCP1质粒转染DOX-诱导Twist1-F表达的HEK293细胞。36 h后，这些细胞用DOX或载药（水）处理6 h，然后用载药（DMSO）或MG132处理6 h。细胞裂解物用抗Twist1、Ser（P）抗体进行Western blotting分析⁶⁸-扭曲1和HA(*HA-SCP1型*)如图所示。Twist1-F和Ser（P）的相对带强度⁶⁸-显示扭转1-F。B类用1μg的dnSCP1、SCP1和/或HA-ubiquitin质粒或空载体（−）转染具有DOX-诱导Twist1-F表达的HEK293细胞。36 h后，用载体（−）或DOX处理这些细胞6 h，然后用MG132再处理6 h。使用FLAG抗体沉淀Twist-F，并使用HA抗体进行Western blotting分析，以检测HA-双喹啉化Twist1-F蛋白。*IB公司*，免疫印迹。C类，三个具有DOX诱导的Twist1-F的HEK293细胞系(重量)用1μg空载体或SCP1和HA-u双肽质粒转染S68A-Twist1-F或S68E-Twist-F表达。36小时后，用载体（−）或DOX处理细胞6小时，然后MG132再处理6小时。使用HA抗体通过免疫印迹检测免疫沉淀的Twist1-Fx蛋白，以检测HA泛素化的Twist1-F、S68A-Twist1-F和S68E-Twist1-F(*扭转1-Fx*).

**图7。**
**SCP1通过干扰Twist1介导的效应抑制细胞迁移和侵袭。** A类，MDA-MB-436细胞（10⁵)用1μg空载体或SCP1和/或Twist1质粒转染。48小时后进行SCP1、Twist1和P-S68-Twistl的免疫印迹分析。*B–D类*，MDA-MB-436细胞（10⁵)用1μg空载体或SCP1和/或Twist1质粒转染。如“实验程序”所述，实时测量生长、迁移和侵袭。细胞指数是细胞密度的相对测量值。E类用对照载体对稳定MCF7细胞系中表达的指示蛋白进行Western blotting分析(*MCF7型^Ctrl键*)或Twist1过度表达(*MCF7型^扭转1*).F、，两行MCF7^扭转1用1μg空质粒或SCP1表达质粒转染细胞，并使用所示抗体进行Western blotting分析。*G公司*，增加SCP1表达抑制MCF7的迁移和侵袭能力^扭转1细胞。两行MCF7^Ctrl键和两行MCF7^扭转1如图所示，用1μg空质粒或SCP1表达质粒转染细胞。按照“实验程序”中的描述进行实时细胞生长、迁移和侵袭试验。通过共同转染GFP表达质粒确定，这些细胞的转染效率超过60%。

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

MAPKs对Twist1丝氨酸68的磷酸化可稳定Twistl蛋白并促进乳腺癌细胞的侵袭性。
洪J，周J，傅J，何T，秦J，王L，廖L，徐J。 Hong J等人。癌症研究2011年6月1日；71(11):3980-90. doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-2914。Epub 2011年4月18日。 2011年癌症研究。 PMID：21502402 免费PMC文章。
SCP1通过去磷酸化c-Myc Ser62调节c-Myc的稳定性和功能。
王伟，廖P，沈M，陈T，陈Y，李Y，林X，葛X，王P。王伟等。致癌物。2016年1月28日；35(4):491-500. doi:10.1038/onc.2015.106。Epub 2015年4月20日。致癌物。2016 PMID：25893300
胸腺醌通过下调TWIST1的表达来减少上皮细胞向间充质细胞的转化，从而抑制肿瘤转移。
Khan MA、Tania M、Wei C、Mei Z、Fu S、Cheng J、Xu J、Fu J。 Khan MA等人。 Oncotarget公司。2015年8月14日；6(23):19580-91. doi:10.18632/目标3973。 Oncotarget公司。2015 PMID：26023736 免费PMC文章。
microRNAs和Twist1转录因子之间的相互作用：系统综述。
Khanbabaei H、Teimoori A、Mohammadi M。 Khanbabaei H等人。肿瘤生物学。2016年6月；37(6):7007-19. doi:10.1007/s13277-016-4960-y.电子出版2016年2月15日。肿瘤生物学。2016 PMID：26880587 审查。
TWIST1在上皮-间质转化和癌症中的作用。
朱QQ、马C、王Q、宋毅、吕T。朱QQ等。肿瘤生物学。2016年1月；37(1):185-97. doi:10.1007/s13277-015-4450-7。Epub 2015年11月24日。肿瘤生物学。2016 PMID：26602382 审查。

查看所有类似文章

引用人

维甲酸诱导C17.2神经干细胞磷酸蛋白质组发生特异性变化。
张C、葛莉、谢赫、刘X、荀C、陈毅、陈H、卢敏、陈平。张C等。《细胞分子医学杂志》，2024年4月；28（7）：e18205。doi:10.1111/jcmm.18205。《细胞分子医学杂志》，2024年。 PMID：38506089 免费PMC文章。
TWIST1在EMT和癌症转移中调节转录的分子机制。
Yu X、He T、Tong Z、Liao L、Huang S、Fakhouri WD、Edwards DP、Xu J。 Yu X等人。 EMBO代表2023年11月6日；24（11）：e56902。doi:10.15252/embr.202356902。Epub 2023年9月8日。 EMBO众议员2023。 PMID：37680145
透明细胞肾细胞癌中小C末端结构域磷酸酶的肿瘤抑制特性。
Krasnov GS、Puzanov GA、Dashinimaev EB、Vishnyakova KS、Kondratieva TT、Chegodaev YS、Postnov AY、Senchenko VN、Yegorov YE。 Krasnov GS等人。国际分子科学杂志。2023年8月19日；24(16):12986. doi:10.3390/ijms241612986。国际分子科学杂志。2023 PMID：37629167 免费PMC文章。
通过药物信息学和动态模拟研究，研究类黄酮支架作为DAX1抑制剂对尤文肉瘤的抑制作用。
Yasir M、Park J、Han ET、Park WS、Han JH、Kwon YS、Lee HJ、Hassan M、Kloczkowski A、Chun W。 Yasir M等人。国际分子科学杂志。2023年5月26日；24(11):9332. doi:10.3390/ijms24119332。国际分子科学杂志。2023 PMID：37298283 免费PMC文章。
MiR-574-5p通过负调控食管鳞癌中的小C末端结构域磷酸酶1促进细胞增殖。
赵C、刘J、徐Y、郭J、王L、陈L、徐L、董G、郑W、李Z、蔡H、李S。赵C等。伊朗基础医学杂志。2022年10月；25(10):1243-1250. doi:10.22038/IJBMS.2022.65886.14492。伊朗基础医学杂志。2022 PMID：36311195 免费PMC文章。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Chandrasekaran S.和King M.R.（2014）肿瘤引流淋巴结的微环境：脂质体靶向治疗的机会。国际分子科学杂志。15, 20209–20239-项目管理咨询公司-公共医学
1. Li S.和Li Q.（2014）肿瘤干细胞与肿瘤转移（综述）。国际期刊Oncol。44, 1806–1812-项目管理咨询公司-公共医学
1. 王毅，周伯平（2013），上皮-间质转化：乳腺癌转移的标志。癌症大厅。1, 38–49-项目管理咨询公司-公共医学
1. Weinberg R.A.（2007）《癌症生物学》，加兰科学出版社，纽约州纽约市
1. Qin Q.，Xu Y.，He T.，Qin C.，Xu J.（2012）Twist1的正常和疾病相关生物功能及其潜在分子机制。细胞研究22，90–106-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

行动
行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

赠款和资金

LinkOut-更多资源

[1] Chandrasekaran S.和King M.R.（2014）肿瘤引流淋巴结的微环境：脂质体靶向治疗的机会。国际分子科学杂志。15, 20209–20239-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Chandrasekaran S.和King M.R.（2014）肿瘤引流淋巴结的微环境：脂质体靶向治疗的机会。国际分子科学杂志。15, 20209–20239-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Li S.和Li Q.（2014）肿瘤干细胞与肿瘤转移（综述）。国际期刊Oncol。44, 1806–1812-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Li S.和Li Q.（2014）肿瘤干细胞与肿瘤转移（综述）。国际期刊Oncol。44, 1806–1812-项目管理咨询公司-公共医学

[5] 王毅，周伯平（2013），上皮-间质转化：乳腺癌转移的标志。癌症大厅。1, 38–49-项目管理咨询公司-公共医学

[6] 王毅，周伯平（2013），上皮-间质转化：乳腺癌转移的标志。癌症大厅。1, 38–49-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Weinberg R.A.（2007）《癌症生物学》，加兰科学出版社，纽约州纽约市

[8] Weinberg R.A.（2007）《癌症生物学》，加兰科学出版社，纽约州纽约市

[9] Qin Q.，Xu Y.，He T.，Qin C.，Xu J.（2012）Twist1的正常和疾病相关生物功能及其潜在分子机制。细胞研究22，90–106-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Qin Q.，Xu Y.，He T.，Qin C.，Xu J.（2012）Twist1的正常和疾病相关生物功能及其潜在分子机制。细胞研究22，90–106-项目管理咨询公司-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

小C末端结构域磷酸酶1通过去磷酸化Ser（P）68-Twist1加速Twist1蛋白降解抑制癌细胞迁移和侵袭

附属公司

小C末端结构域磷酸酶1通过去磷酸化Ser（P）68-Twist1加速Twist1蛋白降解抑制癌细胞迁移和侵袭

作者

附属公司

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

医疗

分子生物学数据库

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

医疗

分子生物学数据库