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.2016年9月22日；35(38):5010-20.
doi:10.1038/onc.2016.53。 Epub 2016年3月14日。

Kras激活和Pten缺失单独或联合对卵巢癌MUC1生物学和上皮间质转化的影响

L Zhang先生 1 2, T Ma公司 三, J布罗齐克 2, K巴巴拉 1, R布迪乌 1 2, G Tseng先生 三, A M弗拉德 1 2
附属公司

单独或联合应用Kras激活和Pten缺失对卵巢癌MUC1生物学和上皮-间质转化的影响

L Zhang先生等。 癌基因. .

摘要

黏蛋白1（MUC1）是一种上皮性糖蛋白，在卵巢癌中过度表达，并积极参与肿瘤细胞的迁移和转移。利用新型的体外和体内MUC1表达条件（Cre-loxP）卵巢肿瘤模型，我们重点研究MUC1生物学以及Kras激活和Pten缺失在细胞转化和上皮-间质转化（EMT）过程中的作用。我们从Kras、Pten或两者均有条件突变的小鼠卵巢表面上皮细胞（OSE）中获得了几种新型小鼠卵巢癌细胞系。此外，我们还生成了一些肿瘤衍生的新细胞系，它们在体内再现了原始的肿瘤表型，反映了晚期转移性疾病。我们的结果表明，致癌Kras的从头激活不会触发增殖增加、细胞转化或EMT，并阻止MUC1上调。相反，Pten缺失加速细胞增殖，在体内外触发细胞转化，并刺激MUC1表达。卵巢肿瘤衍生细胞系MKP-Live和MKP-Lung细胞在体内繁殖EMT，是第一个用于远距离血行播散的免疫活性小鼠模型。使用肿瘤和OSE衍生细胞系进行全基因组微阵列表达分析，发现121个基因特征与EMT和转移相关。当应用于癌症基因组图谱（TCGA）卵巢癌数据集中的n=542例患者时，基因特征识别出生存率降低的患者子集（P=0.04）。通过广泛收集新型小鼠细胞系，我们在体内和体外确定了Kras和Pten在MUC1和EMT上的不同作用。这些数据对针对Kras突变、Pten缺失和MUC1疫苗的联合治疗的未来设计具有指导意义。

PubMed免责声明

利益冲突声明

弗拉德博士的工作得到了美国国立卫生研究院的资助。所有其他作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
Pten抑癌基因的缺失会增加细胞增殖并诱导转化，而致癌Kras的激活会进一步增强这种效应。A.卵巢表面上皮（OSE）细胞是从Kras、Pten或两者都有条件突变的小鼠的健康卵巢中分离出来的。按照材料和方法中的描述，细胞在体外繁殖后永生。获得了上皮形态稳定的细胞株。显示体外培养细胞的图像（5倍放大）。小鼠基因型显示在每张图片的上方。B.PCR结果显示Kras（顶部）和Pten（底部）漂浮。顶部面板：上部带代表KrasG12D位点的Cre-loxP重组。下带显示野生型Kras。下部面板：带的存在表示Pten位点的纯合重组（导致Pten删除/删除). C.用Western blot检测pAkt、Akt，pMek1/2、Mek1/2和β-actin。D.PI染色细胞的细胞周期分析。亲代细胞（左栏）和EV暴露细胞（中栏）作为对照。暴露于AdCre（右栏）的细胞显示由于Kras激活（上排）、Pten缺失（中排）以及Kras活化和Pten联合缺失（下排）对周期的影响。显示了G2/M期细胞的百分比。将E.细胞以相同密度放置在软琼脂中，并对平板进行长达20天的菌落形成监测。将F.MPOSE-AdCre细胞（上图）和MKPOSE-AdCre细胞（下图）注射到同基因小鼠中。处死患有晚期疾病的小鼠，并在尸检时收集肿瘤负荷图像。左柱显示腹水积聚引起的腹胀。右栏显示了许多肿瘤植入物（箭头）。
图2
图2
Kras激活和Pten缺失触发EMT。A.暴露于对照腺病毒（EV，左栏）或AdCre（右栏）的OSE衍生细胞系的图像。B.波形蛋白（顶部）或E-Cadherin（中部）的Western blot鉴定。β-肌动蛋白（底部）用作负荷控制。
图3
图3
来自原发灶和局部及远处转移灶的新生细胞系反映了体内卵巢肿瘤的异质性。A.从患有晚期原位卵巢肿瘤的三重转基因（Tg）MUC1KrasPten（MKP）小鼠中分离出肿瘤组织。体外处理原发肿瘤（T，箭头）和肝脏植入物（L，箭头），并生成两个新的肿瘤衍生细胞系（分别为MKP-T和MKP-liver）。原始T和L卵巢肿瘤的图像显示（HE染色）。B。MKP-T细胞系来源于A（箭头）所示的T肿瘤，当在同基因小鼠体内注射IP时，会产生单个大肿瘤（左）。注射1×10后MKP-T肿瘤切片的HE图像6单元格（右）。C.MKP来源于A中所示的L肿瘤的肝细胞（肝脏植入物，箭头）具有上皮形态（左）。IP注入4×106同基因小鼠中的MKP-肝细胞触发生殖道外隔膜上的多个局部肿瘤植入。MKP-肝肿瘤也转移到肺部。D.使用MKP-肝细胞触发的其中一个肺转移瘤的肿瘤组织生成MKP-肺细胞系。IP注入4×105MKP-肺细胞触发腹膜腔和隔膜上的多个肿瘤植入物（箭头所示，左侧两个面板）。肺转移瘤的HE图像在两个放大镜下显示（右两个面板）。
图4
图4
Kras和Pten对EMT的影响。A.MKP-T、MKP-肝和MKP-肺细胞的形态和生长曲线。B.EMT相关标记物的Western blot。从上到下：ZEB1、扭曲1、扭曲2、波形蛋白、E-钙粘蛋白、细胞角蛋白7（CK7）。β肌动蛋白被用作负荷控制。C.PCR以识别导致外显子5缺失的KrasG12D（顶面，顶面）和Pten（底面）。D.Western blot鉴定PI3K下游（pAkt）和Kras下游（pMek1/2）的磷酸化。β-肌动蛋白起负荷控制作用。
图5
图5
激活的Kras和Pi3k通路对体外MUC1蛋白水平有相反的影响。A.肿瘤衍生细胞系MKP-T、MKP-Live和MKP-Lung上MUC1的流式细胞术测量。显示MUC1阳性细胞百分比。B.细胞表面MUC1在Kras激活（左两个面板）、Pten缺失（中两个面板”）和Kras活化加Pten删除（右两个面板“）后表达OSE-衍生细胞系。将暴露于AdCre的细胞与对照空载体（EV）处理的细胞进行比较。显示MUC1阳性细胞的百分比。C.在两种不同药物浓度下暴露于BEZ235（BEZ）、AZD6244（AZD）或两者（BEZ+AZD。仅DMSO处理的细胞（无Tx）作为对照。显示治疗后6天测定的MUC1阳性细胞百分比。D.上排：培养6天后，MKP-T-2F8细胞暴露于浓度增加的AZD6244后，细胞表面MUC1表达。下一行：停药7天后MUC1表达。E.MUC1在基线检查时和暴露于BEZ235（A2780细胞，左4个面板）或AZD6244（TOV21G细胞，右4面板）四天后表达。药物去除后第7天的MUC1水平显示在相应的下直方图中。在所有分析中，根据同型控制（IC）抗体设置检测MUC1+细胞的门限。IC直方图示例如插图所示。。
图6
图6
EMT相关基因特征可识别存活率降低的患者。A.对6种小鼠肿瘤细胞系的微阵列结果进行无监督聚类分析。每个细胞系重复运行。，其中三种细胞系来源于卵巢肿瘤（MKP-T、MKP-Live和MKP-Lung），三种来源于初级OSE（MKPOSE、MKPOSE-EV和MKPOSE-AdCre）。这六条线分为两个主要簇：MKPOSE-AdCre、MKP-T和MKP-Lung位于簇1中，而MKP-Live、MKPOSE和MKPOSE-EV位于簇2中。B.显示差异表达（DE）基因数量的维恩图（q<0.001），该差异表达是通过MKPOSE-EV与MKPOS-AdCre的比较得出的；MKP-T与MKP-肝；MKP-T对MKP-Lung，MKP-Live对MKP-Lung。共有n=6个DE基因在四组比较中是常见的（红色星号）。共有n=115个基因在三组比较中（蓝色星号）是常见的。补充表2中列出了常见的DE基因（n=121）。C.使用上皮细胞系（星号）和EMT阳性细胞系（箭头）中n=121个常见小鼠基因的热图。。使用微阵列基因表达数据对542例高级别浆液性肿瘤患者的D热图进行研究。患者群显示在顶部。基因簇沿纵轴显示。突出显示的患者群（虚线）显示基因表达变化，与EMT小鼠细胞系中的基因表达变化类似（上调基因，荣誉）。E第1组卵巢癌患者的总体生存分析和Kaplan-Meier曲线如面板D所示（粗线，176名患者），与TCGA患者队列中的其余患者（虚线，366名患者）相比，p=0.04（log-rank检验）。
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