Altered ratios of pro- and anti-angiogenic VEGF-A variants and pericyte expression of DLL4 disrupt vascular maturation in infantile haemangioma

doi:10.1002/path.4715

.2016年6月；239（2）：139-51。

doi:10.1002/path.4715。

婴儿血管瘤中促血管生成和抗血管生成VEGF-A变异体比率的改变以及DLL4周细胞表达扰乱血管成熟

西耶^1 2, 亚西尔·阿布·雷亚^三, 乔伊斯·比肖夫⁴, 艾莉森·里奇², 尼尔·J·塞比尔⁵, 帕特里克·瓦茨⁶, 阿曼达·J·丘吉尔¹, 大卫·O·贝茨²

附属公司

¹英国布里斯托尔大学临床科学学院眼科组。
²英国诺丁汉大学医学院癌症与干细胞科癌症生物学组。
^三英国伦敦摩尔菲尔德眼科医院。
⁴美国马萨诸塞州哈佛医学院波士顿儿童医院血管生物学项目。
⁵组织病理学，英国伦敦大奥蒙德街医院。
⁶英国加的夫威尔士大学医院。

PMID： 26957058
预防性维修识别码：项目经理4869683
内政部： 10.1002/路径4715

婴儿血管瘤中促血管生成和抗血管生成VEGF-A变异体比率的改变以及DLL4周细胞表达扰乱血管成熟

喜业等。病理学杂志. 2016年6月.

.2016年6月；239(2):139-51.

doi:10.1002/path.4715。

作者

西耶^1 2, 亚西尔·阿布·雷亚^三, 乔伊斯·比肖夫⁴, 艾莉森·里奇², 尼尔·J·塞比尔⁵, 帕特里克·瓦茨⁶, 阿曼达·J·丘吉尔¹, 大卫·O·贝茨²

附属公司

¹英国布里斯托尔大学临床科学学院眼科组。
²英国诺丁汉大学医学院癌症与干细胞科癌症生物学组。
^三Moorfields眼科医院，英国伦敦。
⁴美国马萨诸塞州哈佛医学院波士顿儿童医院血管生物学项目。
⁵组织病理学，英国伦敦大奥蒙德街医院。
⁶英国加的夫威尔士大学医院。

PMID： 26957058
预防性维修识别码：项目经理4869683
内政部： 10.1002/路径4715

摘要

婴儿血管瘤（IH）是婴儿最常见的肿瘤，是一种缓慢消退的血管肿瘤。血管内皮生长因子A（VEGF-A）由促血管生成和抗血管生成的变体组成，参与IH的发病机制。然而，不同VEGF-A变异体在IH进展及其自发复旧中的作用尚不清楚。使用患者衍生细胞和手术标本，我们发现在IH退化期VEGF-A165 b的相对水平增加，VEGF-A亚型的相对变化可能依赖于IH干细胞的内皮分化。VEGFR信号调节IH细胞功能，VEGF-A165 b在体内外抑制细胞增殖和IH内皮细胞的血管生成潜能。VEGF-A165 b对血管生成的抑制与VEGF受体2（VEGFR2）的激活和降解程度以及δ样配体4（DLL4）的表达有关。这些结果表明，VEGF-A变异体可以通过细胞分化进行调节，并参与IH进展。我们还证明，DLL4的表达不仅限于IH中的内皮细胞，也存在于周细胞中，周细胞中没有VEGFR2的表达，这表明周细胞衍生的DLL4可以独立于VEGFR2阻止退化过程中的发芽。因此，IH中的血管生成似乎由内皮内的DLL4以VEGF-a同种型依赖的方式控制，并在血管周围细胞中以VEGF非依赖的方式控制。VEGF-A亚型对疾病进展的贡献也表明IH可能与剪接改变有关。©2016作者。John Wiley&Sons Ltd代表大不列颠及爱尔兰病理学会出版的《病理学杂志》。

关键词：血管生成；内皮细胞；血管瘤；血管内皮生长因子。

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数字

图1
VEGF-A亚型水平的变化与IH退化一致。（A）增殖期组织(n个 = 8名患者）和退化期(n个 = 11例IH患者）用总VEGF-a抗体染色，在IH增殖期和退化期之间，总VEGF-a无差异。（B）血管内皮生长因子-a染色的区域_xxx个抗体和归一化细胞数显示VEGF-a显著减少_xxx个渐开线中的a(n个 = 10） IH期与增殖期比较(n个 = 5）相位(第页 < 0.05，双尾t‐测试）。（C）血管内皮生长因子-A_xxx个b在血管瘤消退期比增殖期增加(第页 < 0.05，双尾t‐测试）。（D）用浓度增加的PTK787（一种VEGFR抑制剂）处理HemSC和HemEC，PTK787VEGFR以浓度依赖性的方式显著抑制HemCC和HemECs的增殖(第页 < 0.001，单向方差分析，Bonferroni事后（post-hoc）测试；n个 = 5). 比例尺 = 50 微米*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001; NS，不显著

图2
HemEC和HemSC的内皮分化与VEGF-A相关₁₆₅b上调监管。（A） mRNA水平的测定血管内皮生长因子-A通过RT–qPCR在HemEC和HemSC中(n个 = 3名患者）。（B）跨外显子7和8b的RT–PCR引物图，从而扩增VEGF‐A₁₆₅a和VEGF-a₁₆₅b.（C）HemEC和HemSC的RT-PCR以及含有VEGF-A重组cDNA的质粒₁₆₅a和VEGF-a₁₆₅b、或两者等量的混合物(n个 = 3名患者）：MWM，分子量标记；−RT，无逆转录酶。（D） VEGF‐A和VEGFA总量的评估₁₆₅夹心ELISA法检测HemEC和HemSCs裂解物中的b蛋白(n个 = 3名患者）。（E） ELISA法测定分化和未分化HemSC中的总VEGF-A。（F） VEGF-A的测量₁₆₅通过ELISA检测分化和未分化HemSC中的b。（G）从未分化或分化HemSC中提取的蛋白质的免疫印迹显示，与VEGF-A对应的条带大小强度降低₁₆₅a和VEGF-a₁₆₅b、使用总VEGF-a抗体（箭头所示）(第页 < 0.05;n个 = 3）以及与VEGF‐A相对应的条带强度增加₁₆₅b分子量，使用VEGF‐A₁₆₅b抗体(第页 < 0.05;n个 = 3）（箭头）：比VEGF-a分子量更高的附加带（#）₁₆₅a或VEGF-a₁₆₅在HemSC分化后持续检测到b；所有分析都使用双尾时间测试

图3
血管内皮生长因子-A₁₆₅b调节IH中的新生血管生成。（A）血管内皮生长因子-A_xxx‐年b、人类IH切片的CD31和细胞核（DAPI）染色：增殖性IH的组织学特征从早期、难以识别且大多无管腔的微血管（i–iii）转移到增殖期晚期/退化早期（iv–vi）更为结构化的血管最后是退化期（vii–ix）具有明确扩大管腔的微血管；血管内皮生长因子-A_xxx个随着内皮细胞成熟并组织成明确的管腔结构，b染色更多地局限于微血管。（B）用VEGF‐A治疗HemEC₁₆₅a、血管内皮生长因子-a₁₆₅b或两者都在NHDF单层上，使用在体外血管生成分析：HemECs用VE‐钙粘蛋白染色。（C–E）定量（B）：2.5 n个米血管内皮生长因子-A₁₆₅a诱导管面积（C）、长度（D）和分支（E），与未处理的相比，2.5 n个米血管内皮生长因子-A₁₆₅b或用2.5处理的HemEC n个米血管内皮生长因子-A₁₆₅a和VEGF-a₁₆₅b条(n个 = 三；第页 < 0.001，单向方差分析）。比例尺 = 100 微米

图4
血管内皮生长因子-A₁₆₅b抑制IH小鼠模型中的血管生成并抑制IH细胞增殖在体外（A）HemEC–HemSC–Matrigel植入物经15次治疗微克 s.c.rhVEGF‐A₁₆₅b条(n个 = 5）或盐水(n个 = 8）每周两次，为期两周。将植入物切片，用H&E染色，并对充满血液的管腔进行计数（箭头所示）。用rhVEGF-A治疗的植入物₁₆₅b组微血管密度低于生理盐水组(n个 = 8;第页 < 0.01）。（B）用rhVEGF-A治疗的植入物₁₆₅b条(n个 = 6）形成更少的人CD31⁺微血管比盐水处理的微血管(n个 = 8;第页 < 0.001，双尾学生t‐测试）。（C，D）HemSC（C）和HemEC（D）用1 µg/ml血管内皮生长因子-A₁₆₅24-96的b中和抗体完整EGM‐2中的h：48、72和96时的电池数量 h被归一化为24小时时的细胞数小时(n个 = 三；第页 < 0.05，双向方差分析，Bonferroni事后（post-hoc）与IgG进行比较）。（E） HemEC在完整的EGM‐2中用规定浓度的rhVEGF‐A处理₁₆₅b代表48 h；对细胞进行DAPI和Ki67染色。（F）（E）的量化：增殖HemEC的百分比不受5或10的影响 n个米重组血管内皮生长因子-A₁₆₅b；用10 n个米血管内皮生长因子-A₁₆₅与未经治疗的相比。比例尺 = 50 微米*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.01; NS，不显著

图5
VEGFR2信号、降解和下游靶点受VEGF-A亚型的差异调节。在用2.5 n个米血管内皮生长因子-A₁₆₅a、血管内皮生长因子-a₁₆₅b或两者。（A、B）血管内皮生长因子-A₁₆₅HemSC和HemEC中诱导的VEGFR2信号和ERK1/2下游激活；血管内皮生长因子-A₁₆₅b在HemSC和HemEC中弱激活VEGFR2和ERK1/2；血管内皮生长因子-A₁₆₅b抑制VEGF-A₁₆₅a介导的HemSCs和HemEC中的VEGFR2和ERK1/2磷酸化。（C） HemEC接受2.5 n个米血管内皮生长因子-A₁₆₅a和VEGF-a₁₆₅b和在所示时间点提取的蛋白质。（D）（C）的量化：用VEGF-A治疗₁₆₅b、但不是VEGF‐A₁₆₅a、 VEGFR2水平显著降低；n个 = 三；第页 < 0.05，单向方差分析*第页 < 与VEGF-A相比，0.05₁₆₅b；^# 第页 < 与时间0相比，0.05。（E）如上所述处理HemEC，提取RNA并进行RT-qPCR以检测DLL4的表达；第页 < 0.001，方差分析。（F）血管内皮生长因子-A₁₆₅a诱导的DLL4表达与未处理的比较(n个 = 三；第页 < 0.05，单向方差分析）；血管内皮生长因子-A₁₆₅b、单独或与VEGF‐A一起₁₆₅a、在蛋白水平上未诱导DLL4表达*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.01; NS，不显著

图6
内皮外DLL4信号抑制HemECs血管生成。（A） HemEC与正常人皮肤成纤维细胞共同培养，并用来自CHO细胞的条件培养基处理，未转导（阴性）或转导GFP（Ad.GFP）或sDLL4腺病毒（Ad.DLL4）和VEGF-A₁₆₅a或VEGF‐a₁₆₅b；然后对细胞进行VE‐钙粘蛋白染色。（B–D）（A）的定量：VEGF‐A₁₆₅a、不是VEGF‐a₁₆₅b、实验中诱导内皮管延伸、分支和覆盖(n个 = 三；第页 < 0.001); 感染ad.sDLL4的CHO细胞的条件培养基抑制在体外HemEC的血管生成潜能，与存在的VEGF-A亚型无关(n个 = 三；第页 < 0.001，双向方差分析）。（E）对IH切片进行NG2和DLL4染色：显示IH增殖和退化的典型染色；增殖期NG2染色较低；在退化期，DLL4染色与NG2阳性细胞共同定位在组织更为有序的血管中的比例相对较高。（F）在HemEC和IH周细胞中发现DLL4蛋白表达，但在IH周胞中未检测到VEGFR2蛋白。比例尺 = 100 微米

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[5] Khan ZA、Boscolo E、Picard A等。多潜能干细胞在免疫缺陷小鼠中重现人类婴儿血管瘤。《临床投资杂志》2008年；118: 2592–2599.-项目管理咨询公司-公共医学

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