Lack of VEGFR2 signaling causes maldevelopment of the intestinal microvasculature and facilitates necrotizing enterocolitis in neonatal mice

doi:10.1152/ajpgi.00273.2015

.2016年5月1日；310（9）：G716-25。

doi:10.1152/ajpgi.00273.2015。 Epub 2016年2月25日。

缺乏VEGFR2信号会导致新生小鼠肠道微血管发育不良，并促进坏死性小肠结肠炎

杨晓才¹, 伊丽莎白·马纳利亚¹, 雪莉Xl Liu¹, 小迪谭², 小王², 凯瑟琳·马雷克¹, 伊莎贝尔·G·德普莱恩^三

附属公司

¹伊利诺伊州芝加哥市费恩伯格医学院西北大学安·罗伯特·卢里儿童医院儿科新生儿科；Stanley Manne儿童研究所肠道和肝脏炎症研究中心、Ann&Robert H.Lurie芝加哥儿童医院、西北大学、Feinberg医学院、伊利诺伊州芝加哥。
²伊利诺伊州芝加哥市费恩伯格医学院西北大学安·罗伯特·H·卢里儿童医院儿科消化科；以及肠道和肝脏炎症研究中心、斯坦利·曼恩儿童研究所、芝加哥安&罗伯特·H·卢里儿童医院、西北大学、伊利诺伊州芝加哥芬伯格医学院。
^三伊利诺伊州芝加哥市费恩伯格医学院西北大学安·罗伯特·卢里儿童医院儿科新生儿科；Stanley Manne儿童研究所肠道和肝脏炎症研究中心、Ann&Robert H.Lurie芝加哥儿童医院、西北大学、Feinberg医学院、伊利诺伊州芝加哥isabelledp@nortwestern.edu。

PMID： 26950855
预防性维修识别码：项目经理4867326
内政部： 10.1152/ajpgi.00273.2015年

VEGFR2信号缺失导致新生小鼠肠道微血管发育不良并促进坏死性小肠结肠炎

杨晓才等。美国生理学杂志胃肠测试肝脏生理学. 2016.

.2016年5月1日；310（9）：G716-25。

doi:10.1152/ajpgi.00273.2015。 Epub 2016年2月25日。

作者

杨晓才¹, 伊丽莎白·马纳利亚¹, 雪莉Xl Liu¹, 小迪谭², 小王², 凯瑟琳·马雷克¹, 伊莎贝尔·G·德普莱恩^三

附属公司

¹伊利诺伊州芝加哥市费恩伯格医学院西北大学安·罗伯特·卢里儿童医院儿科新生儿科；Stanley Manne儿童研究所肠道和肝脏炎症研究中心、Ann&Robert H.Lurie芝加哥儿童医院、西北大学、Feinberg医学院、伊利诺伊州芝加哥。
²伊利诺伊州芝加哥市费恩伯格医学院西北大学安·罗伯特·H·卢里儿童医院儿科消化科；以及肠道和肝脏炎症研究中心、斯坦利·曼恩儿童研究所、芝加哥安&罗伯特·H·卢里儿童医院、西北大学、伊利诺伊州芝加哥芬伯格医学院。
^三伊利诺伊州芝加哥市费恩伯格医学院西北大学安·罗伯特·卢里儿童医院儿科新生儿科；Stanley Manne儿童研究所肠道和肝脏炎症研究中心、Ann&Robert H.Lurie芝加哥儿童医院、西北大学、Feinberg医学院、伊利诺伊州芝加哥isabelledp@nortwestern.edu。

PMID： 26950855
预防性维修识别码：项目经理4867326
内政部： 10.1152/ajpgi.00273.2015年

摘要

坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种影响早产儿的常见胃肠道疾病，其发病机制尚不清楚。我们之前发现，在可检测到组织损伤之前，人类NEC样品和新生小鼠NEC模型中的肠道VEGF-A表达降低。因此，我们假设VEGF受体2（VEGFR2）信号缺失通过损害肠道微血管发育促进新生儿肠道损伤。在这里，我们发现小鼠的肠道VEGF-A及其受体VEGFR2在胎龄结束时高度表达，出生后显著降低。此外，选择性抑制VEGFR2激酶活性和接触新生儿NEC方案显著降低了肠道微血管网络的密度，当两种干预措施同时提供时，该密度进一步降低。此外，VEGFR2抑制导致NEC模型中幼鼠的死亡率和严重损伤发生率更高。固有层内皮细胞的百分比在NEC诱导期间降低，并且当VEGFR2信号传导被抑制时进一步降低。这与内皮细胞增殖减少而非凋亡有关。总之，我们发现VEGF-A和VEGFR2蛋白在出生前在肠道中高度表达，在新生儿期显著下调。此外，VEGFR2信号对于维持出生后肠道粘膜微血管的完整性是必要的，并且VEGFR2缺乏信号容易导致新生小鼠出现NEC。

关键词：VEGF-A/VEGFR2；血管生成；坏死性小肠结肠炎；脉管发育。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
出生前，VEGF-A及其受体VEGFR2在小鼠肠道中高度表达。实验性坏死性小肠结肠炎（NEC）小鼠幼鼠的肠道VEGF-A和VEGFR2减少。从胚胎第16天（E16）到出生第2天的小鼠幼崽中获取肠组织(A类)和接受NEC方案24小时或母婴（DF）窝友控制的幼崽(B类). 用小肠组织裂解物的Western blot分析VEGF-A和VEGFR2蛋白(A类和B类)通过福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫荧光检测其细胞定位，使用抗VEGF-A或抗VEGFR2抗体（绿色）和DAPI对细胞核进行反染（蓝色）(C类，比例尺=100μm）。在使用不同窝产卵的两个单独实验中获得了类似的结果。标准化为β-肌动蛋白的带密度测量数据如所示(A类,底部)和(B类,*正确的*). 对于VEGF120，在膜长期暴露后进行密度测定分析**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001. 箭头输入C类指向肌间神经丛。在DF、SU5416处理的幼崽或VEGFR2免疫沉淀后暴露于NEC的幼崽中检测到肠道磷酸酪氨酸水平(D类,左边). 来自相同样本的VEGFR2总水平如所示D类,*正确的*.

**图2。**
在肠绒毛中，VEGF-A定位于内皮细胞和肠内分泌细胞，而其受体VEGFR2定位于血管内皮细胞。为了确定哪些细胞表达VEGF-A和VEGFR2，从48小时龄的DF幼崽的肠道组织切片与抗VEGF-A抗体和抗CD31抗体（一种内皮细胞标记物）共染色(A类)并对抗肠内分泌细胞标记物色甘素A(B类). 其他切片同时含有抗VEGFR2和抗CD31抗体(C类).D类：对48小时龄DF CX3CR1-GFP转基因幼鼠的小肠组织切片进行VEGF-A染色(顶部)或VEGFR2(底部)并与抗GFP抗体联合检测CX3CR1-髓样细胞是否产生VEGF-A/VEGFR2。比例尺=20μm inA类——D类.箭头在A类指向肌间神经丛。

**图3。**
阻断VEGFR2激酶活性会增加NEC的发病率和严重程度。DF幼崽或接受实验NEC方案的幼崽注射（ip）20 mg/kg SU5416(A类——C类和F类)或1 mg/kg Ki8751(D类和E类)或每天进行车辆控制。代表性照片(顶部)和组织学图片(底部)每组（SU5416实验）的结果如所示A类.比例尺=100µm。NEC组织学评分见B类（SU5416）和D类（Ki8751）。幼犬存活曲线如所示C类（SU5416）和E类（Ki8751）。B类,n个=DF组14例，SU5416组15例，NEC组32例，NEC+SU5416组合29例；C类,n个=DF组20例，SU5416组19例，NEC组和NEC+SU5416各组各38例；D类,n个=DF组16例，SU5416组12例，NEC组31例，NEC+SU5416组合35例；E类,n个=DF组16例，SU5416组13例，NEC组38例，NEC+SU5416组合44例****P（P）*<0.001*****P（P）*< 0.0001. 这些数据是2到3个分离实验的综合结果。F类：在DF中肠内给予800 mg/kg FD4 4 h后，通过血清FITC-右旋糖酐（FD4）浓度测量肠道通透性(n个=22），SU5416(n个=11），需要(n个=14），和NEC+SU5416幼犬(n个= 14). 数据表示三个独立实验的组合**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.005, *****P（P）*< 0.0001.

**图4。**
VEGFR2的抑制和NEC方案的暴露降低了肠道血管网络密度，这些干预是协同作用的。幼犬只注射（ip）SU5416或溶媒，和/或接受NEC方案。48小时后，将Alexa Fluor 647-共轭小麦胚芽凝集素（WGA）通过心内灌注给幼崽，并在×10倍放大镜下对肠道微血管成像(A类和B类，比例尺=200μm）。C类：血管面积百分比被确定为血管密度的指标**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001; 计数的随机字段数C类结果如下：DF，11；DF+SU5416，7；NEC，9；和NEC+SU5416，7。数据来自两个单独的实验，共使用3窝幼崽。D类：对接受48小时NEC的幼崽的凝集素WGA灌注的小肠组织进行福尔马林固定和石蜡包埋。切片用抗CD31抗体和DAPI染色（比例尺=20μm）。

**图5。**
VEGFR2的抑制和NEC方案的暴露降低了内皮细胞增殖，这些干预是协同作用的。幼崽在安乐死和肠道组织采集前4 h注射5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）。肠组织切片与BrdU（红紫色）和CD31（绿色）抗体共染色，以定位增殖的内皮细胞。A类：CD31（绿色）和BrdU（红色）的共定位（×63倍放大，比例尺=20μm）。B类：在注射或不注射SU5416的情况下，从DF或NEC幼崽身上取下的×20放大视野的放大部分（比例尺=80μm）。C类：增殖内皮(左边)和上皮(*正确的*)在每个样品的3个视野中，以×20倍放大率对绒毛细胞进行计数，并计算BrdU的平均数量⁺显示每个场的内皮细胞。DF、，n个= 4; DF+SU5416，n个= 4; NEC、，n个= 6; 和NEC+SU5416，n个= 4. 数据是在两个单独的实验中从3窝中获得的。D类：显示增殖内皮细胞的条形图(左边)和上皮细胞(*正确的*)DF幼崽组织中每片绒毛的数量(n个=9），DF+Ki8751(n个=8），NEC(n个=8）和NEC+Ki8751(n个= 6). 数据来自2个分离实验中的5窝幼崽****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001.

**图6。**
NEC肠组织中的内皮细胞数量减少，当VEGFR2通路受到抑制时，内皮细胞数量进一步减少。用EDTA分解肠道组织细胞，然后进行胶原酶消化。生成单细胞悬浮液，用指示标记物染色，并用流式细胞仪进行分析。CD31的百分比⁺显示了活细胞、非上皮细胞和非内皮细胞衍生细胞群中的细胞。A类：代表性直方图显示CD31的下降百分比⁺NEC中的细胞(*中间的*)和NEC/SU5416(*正确的*)组与DF对照组比较(左边).B类：显示多个样本平均值的条形图，包括A类(n个=每组3人**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.005). 两个独立实验的结果相似。C类：代表性直方图显示CD31百分比下降⁺注射SU5416的DF幼崽的细胞(*正确的*)与DF控件相比(左边).D类：显示多个样本平均值的条形图，包括C类(n个=每组6人***P（P）*< 0.01). 两个单独实验的结果相似。

**图7。**
接触NEC方案会增加上皮细胞凋亡，而VEGFR2抑制不会影响上皮细胞凋亡。CD31细胞表面免疫荧光染色后，对DF、SU5416处理组、NEC和NEC+SU5416组幼鼠的肠组织切片进行TUNEL染色。A类：尽管NEC和NEC+SU5416组均发现许多凋亡上皮细胞，但在这些组的肠绒毛中仅很少观察到凋亡内皮细胞（标尺=100μm）。底部：放大视野。顶部：放大20倍拍摄图像。B类：每个字段计数的TUNEL阳性上皮细胞的平均数量(*****P（P）*< 0.0001,n个=每组3只动物）。结果代表两个单独的实验。

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[3] Bergmann KR、Liu SX、Tian R、Kushnir A、Turner JR、Li HL、Chou PM、Weber CR、De Plaen IG。在小鼠坏死性小肠结肠炎中，双歧杆菌稳定紧密连接处的克劳丁并防止肠屏障功能障碍。《美国病理学杂志》182:1595–16062013。-项目管理咨询公司-公共医学

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