Intracellular pH Modulates Autophagy and Mitophagy

doi:10.1074/jbc.M115.691774

.2016年4月15日；291（16）：8701-8。

doi:10.1074/jbc。M115.691774。 Epub 2016年2月18日。

细胞内pH调节自噬和吞噬

阿列克谢·别列日诺夫¹, 马克·P·M·苏达², 叶甫盖尼亚·费多托娃¹, 玛丽亚·S·弗洛洛娃¹, 海伦·普伦·法夫罗², 瓦莱里·辛琴科¹, 安德烈·阿布拉莫夫^三

附属公司

¹来自俄罗斯科学院细胞生物物理研究所细胞内信号传递系，地址：俄罗斯联邦莫斯科地区普什基诺，邮编：142290。
²伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场。
^三伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场a.abramov@ucl.ac.uk。

PMID： 26893374
预防性维修识别码：项目经理4861439
内政部： 10.1074/jbc。M115.691774号

细胞内pH调节自噬和吞噬

阿列克谢·别列日诺夫等。生物化学杂志. 2016.

.2016年4月15日；291(16):8701-8.

doi:10.1074/jbc。M115.691774。 Epub 2016年2月18日。

作者

阿列克谢·别列日诺夫¹, 马克·P·M·苏达², 叶甫盖尼亚·费多托娃¹, 玛丽亚·S·弗罗洛娃¹, 海伦·普隆·法夫罗², 瓦莱里·辛琴科¹, 安德烈·阿布拉莫夫^三

附属公司

¹来自俄罗斯科学院细胞生物物理研究所细胞内信号传递系，地址：俄罗斯联邦莫斯科地区普什基诺，邮编：142290。
²伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场。
^三伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场a.abramov@ucl.ac.uk。

PMID： 26893374
预防性维修识别码：项目经理4861439
内政部： 10.1074/jbc。M115.691774号

摘要

线粒体的特异性自噬消除（有丝分裂）对这种细胞器起着质量控制的作用。有丝分裂的放松调节导致受损线粒体数量增加，并触发细胞死亡。据推测，有丝分裂的恶化是几种神经退行性疾病的发病机制的基础，尤其是帕金森病。尽管线粒体质量控制的一些生化和分子机制已被详细描述，但有丝分裂的生理或病理触发因素仍未完全确定。这里我们表明，线粒体解偶联剂FCCP诱导的有丝分裂与线粒体膜电位的影响无关，但依赖于FCCP对胞浆的酸化。离子载体黑精还可降低细胞溶质pH值，并诱导PINK1/PARKIN依赖性和非依赖性的有丝分裂。莫能菌素增加细胞内pH值可抑制FCCP和尼日尔菌素对线粒体降解的影响。因此，细胞内pH值的变化是线粒体质量控制的调节器。

关键词：自噬；细胞内pH值；溶酶体；线粒体；有丝分裂；神经变性。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**FCCP和尼葛酸对[pH]的影响_c（c）.**FCCP诱导SHSY5Y神经母细胞瘤细胞pH值的剂量依赖性降低(A类和B类). 10 μ米与1μ米这个原核生物。C类，[pH]的变化_c（c）SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞对随后应用不同浓度的尼葛霉素和FCCP的反应。D类，尼格瑞辛和FCCP对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞内pH影响的剂量依赖性曲线。

**图2。**
**黑精和不同浓度FCCP对线粒体膜电位的影响。**ΔΨ的变化_米在去猝灭模式下使用Rh123进行测量；电势的损失被视为荧光的增加。A类，表示线粒体完全去极化后Rh123荧光最大增加1μ米FCCP后应用10μ米FCCP对Rh123荧光没有影响。B类，影响6μ米尼葛酸对ΔΨ的影响_米SH-SY5Y电池(*灰色线条*)然后线粒体完全去极化10μ米FCCP公司。

**图3。**
**FCCP和尼葛霉素诱导SH-SY5Y细胞胞浆pH酸化的来源。**细胞外pH值（HBSS）从7.4降至6.35不会改变10μ米催化裂化装置(A类)但会降低尼日尔金的作用(B类). 0.2μg/ml寡霉素+5μ对线粒体膜的去极化作用米鱼藤酮(C类)但不仅仅是寡霉素(D类)对10μ米FCCP公司。5 μ米抗霉素A(E类)或1μ米催化裂化装置(F类)降低细胞内pH值并降低3μ米尼日利亚。*G公司*，20μ的影响米碘乙酸对10μ米FCCP（pH值）_c（c）.H（H），钠的抑制剂⁺/H（H）⁺在浓度为10和50μ米.

**图4。**
**溶酶体在FCCP和nigerin诱导SH-SY5Y细胞胞浆酸化中的作用。** A类，用巴非霉素预培养细胞可显著降低10μ米FCCP公司。注意，1μ米FCCP对对照组也有类似的影响。GNP对FCCP的影响（10μ米;B类)或尼日尔霉素（3μ米;C类)-诱导SH-SY5Y细胞胞浆pH值变化。

**图5。**
**尼日利亚霉素激活自噬，独立于典型的PINK1/Parkin通路。**用1μ米尼葛酸，1或10μ米细胞裂解物分馏（线粒体富集）、SDS-PAGE和Western blotting之前，FCCP或DMSO控制2小时(A类，请参阅中的摘要B类)或免疫细胞化学(C类). Western blots中每条泳道的蛋白质含量相同。A类在SDS-PAGE凝胶上分离线粒体富集组分，并对线粒体（CV、TOM20、COXII、TIM23）和线粒体吞噬途径（PINK1、FLAG-Parkin、视神经素和丝裂原）进行蛋白质印迹。代表性的Western印迹来自n个=3个独立实验。使用ANOVA（Dunnetts多重比较）确定显著性*，第页= 0.05; **,第页=0.01，CV用作加载控制。C类免疫细胞化学图像显示弥漫性Parkin（抗FLAG，红色)线粒体的模式和网络（抗HtrA2，绿色)在对照细胞中。孵育10μ米FCCP，Parkin（FLAG）被募集到线粒体（HtrA2），由*黄色的*共同定位，破坏线粒体网络。这种过程在尼格雷金处理的细胞中不存在。

**图6。**
**细胞处理24h后，FCCP和尼日尔金对有丝分裂的影响相似。** A类和B类，FLAG-Parkin SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞用1μ米黑色素，1μ米FCCP，10μ米FCCP或DMSO对照24小时。在SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解物，并对线粒体（CV、TOM20、COXII、TIM23）和线粒体自噬途径（FLAG Parkin和线粒体融合蛋白）标记物进行Western印迹，同时使用肌动蛋白作为负载对照。Western blots中的每条泳道使用相同的蛋白质负荷。代表性的Western印迹来自n个=3个独立实验。使用Anova（Dunnetts多重比较）**确定显著性，第页= 0.01.C类免疫细胞化学图像显示弥漫性Parkin（抗FLAG，绿色)线粒体的模式和网络（抗CV，红色)在对照细胞中。孵育10μ米FCCP或1μ米尼葛霉素作用24小时，Parkin（FLAG）被补充到线粒体（CV）*黄色的*共同本地化。D类，FLAG-Parkin SHSY5Y神经母细胞瘤细胞用1μ米黑色素，1μ米, 10 μ米细胞裂解物分离（线粒体富集）和SDS-PAGE前，FCCP或DMSO控制2小时。使用CV（线粒体）和GAPDH（胞质）通过Western blotting细胞质和富含线粒体的样品来确定分离效率。

**图7。**
**pH引起线粒体和溶酶体共同定位的变化。** A类线粒体与溶酶体共定位。双通道共焦图像(A类)被拆分为绿色（线粒体，艾岛)和红色（溶酶体，艾伊)使用ImageJ软件的频道。这两幅8位图像都进行了阈值分割(*Aiii公司*,*Aiv公司*). 计算线粒体面积。线粒体和溶酶体重叠的区域(*黄色的*)已确定(平均,阿维)，并计算其面积。B类，对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞进行2小时预处理的10μ米FCCP或6μ米nigerin增加线粒体的数量（MitoTracker Green，绿色)定位于溶酶体中（LysoTracker红，红色). 棒材为20μm。C类，用不同浓度的FCCP和尼葛霉素预处理2h后，线粒体定位于溶酶体的百分比。D类、莫能菌素对FCCP的影响和尼日尔霉素诱导的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞胞浆酸化。E类，用3μ米尼葛酸或10μ米FCCP 30分钟，随后用10μ米莫能新。莫能新（10μ米)和10或50μ米DMA也在没有FCCP或尼日尔霉素的情况下进行了测试。

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