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.2016年2月18日；12(2):858.
doi:10.15252/msb.20156662。

位置蛋白质组学揭示了N-末端蛋白质组稳定性的差异

达里亚·加伦 1, 埃尔维斯·恩达 2, 克里斯·格瓦尔特 1, 佩特拉·范·达姆 三
附属公司

位置蛋白质组学揭示了N-末端蛋白质组稳定性的差异

达里亚·加伦等。 分子系统生物. .

摘要

为了了解替代翻译起始对蛋白质组的影响，我们利用位置蛋白质组学和核糖体分析对蛋白质周转进行了全蛋白质组研究，以区分单个基因的N末端蛋白质组。通过将脉冲SILAC与N-末端COFRADIC相结合，我们监测了1941种人类N-末端蛋白形式的稳定性，包括147对N-末端蛋白形式对，它们来源于起始甲硫氨酸的选择性翻译起始、选择性剪接或不完全加工。N末端截短的蛋白质组比标准蛋白质组数量少，并且经常显示出改变的稳定性，这可能归因于单个蛋白质特征，包括内在紊乱，但与N末端氨基酸的特性或截短长度无关。我们发现，甲硫氨酸氨肽酶去除引发剂甲硫氨酸会降低加工蛋白质的稳定性，而N-末端乙酰化的敏感性似乎不会影响蛋白质周转率。综上所述，我们的研究结果揭示了N末端蛋白质组之间蛋白质稳定性的差异，并指出在蛋白质组稳态的整体调节中，除了选择性剪接之外，选择性翻译起始和共翻译起始物蛋氨酸去除也发挥了作用。

关键词：N末端蛋白质组；替代翻译启动；引发剂蛋氨酸加工；蛋白质稳定性；核糖体分析。

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数字

图1
图1。N末端蛋白质组的起源
  1. A类

    共鉴定出2578个蛋白质组，包括2135个dbTIS和443个aTIS。对于大多数蛋白质，我们发现了一个独特的翻译起始位点（灰色）。此外，335个N末端肽指向通过交替翻译起始（蓝色）产生的具有多个N末端的蛋白质，而81个N末端是通过交替iMet处理产生的（绿色）。

  2. B、 C类

    利用在Jurkat细胞和HCT116细胞中获得的Ribo‐Seq数据在转录水平验证蛋白质组学衍生的翻译起始事件（数据未发表）。虽然在本研究中体内不能直接测定N-乙酰化，所有保留的N-末端都符合N-末端处理的规则（Van Damme等, 2014). 在这种情况下，发现N端子体内N-乙酰化（之前基于MS/MS的证据，Van Damme等，2014），显示此信息。dbTIS和aTIS肽被进一步映射到瑞士Prot Isoform、UniProt TrEMBL和Ensembl数据库中注释的蛋白质N末端，以及TopFind 3.0知识库中的新N末端（蛋白水解产物）。匹配的N端子数量以深灰色表示。由至少一个指向翻译的元数据来源（Nt-乙酰化、Ribo-Seq、Swiss-Prot异构体、TrEMBL或Ensembl）支持的N端肽被归类为高度自信的TIS（以绿色表示）。

  3. D类

    通过实验和元数据，我们确定了aTIS肽的最可能来源，并确认同一转录物中的替代翻译起始（泄漏扫描）有助于识别出大多数替代TIS。

图2
图2。Ribo‐Seq在Jurkat细胞中证实的翻译起始事件示例
  1. A、 B类

    由于扫描泄漏而导致的替代翻译启动。

  2. C类

    替代拼接。

  3. D类

    N末端截短的蛋白质组的优先表达。

  4. E、 F类

    交替翻译起始发生在两个连续的AUG密码子的证据。

图3
图3。实验设置使用pSILAC公司和N端子COFRADIC公司评估N末端蛋白质组稳定性

  1. Jurkat细胞用轻或中等L‐Arg同位素预先标记。对生长在Arg培养基中的细胞进行标签交换，而光细胞则在相同的培养基中培养。在不同的时间点采集细胞，混合等量的蛋白质组，然后进行N端COFRADIC和LC-MS/MS分析。

  2. 三种动态形式的N末端肽之间的比率反映了蛋白质合成和降解速度，允许计算50%的周转时间。

  3. 周转时间分布(N个=1894）的计算结果不是单峰的，有大量快速翻转的蛋白质，蛋白质周转率中值为21.6小时。Jurkat细胞的加倍时间（24小时）用红色表示。

图EV1
图EV1。使用可用数据点子集计算周转时间

  1. 在七个时间点发现的具有代表性的蛋白质组（10）显示了多种周转率。

  2. 对于每个肽，用指数模型拟合3个随机点的所有可能组合，并用于计算50%的周转时间。接下来，使用R（右） 2系数低于0.8被拒绝。其余有效模型按肽分组，并用方框图表示。

图EV2
图EV2。对于至少在三个时间点（1972年）量化的每个蛋白质组，指数模型无法解释的数据变化计算为（1−R（右） 2)并以%表示
未解释变化的分布集中在2%左右（对应于中位数R（右） 2=0.98），而只有少数指数模型拟合不足(R（右） 2<0.8），并被拒绝。
图EV3
图EV3。Jurkat细胞倍增时间的实验分配
在48小时内对细胞培养密度进行三次监测，并使用加倍时间在线计算器拟合指数模型(http://www.doubling-time.com/compute.php). 根据指定的生长速率（0.0288）计算细胞加倍时间，如下所示：ln（2）/0.0288，单位为小时。
图4
图4。GO（开始）不稳定（A）和稳定（B）蛋白质的术语富集分析
  1. A、 B类

    水平条形图表示为显著丰富的GO（开始）人类蛋白质组术语(财务总监 q个值≤0.05）。

图5
图5。已鉴定N末端蛋白质组的特征

  1. 我们指定了1941个蛋白质组的周转时间，其中1894个蛋白质组来自1571个dbTIS，323个aTIS位于替代iMet处理产生的47个N末端附近。dbTIS和aTIS衍生的蛋白质组分别以蓝色和红色表示。来自同一基因的100个N末端蛋白质组对的稳定性（深红色）。

  2. iMet位置的分布导致产生323个具有指定周转时间的N末端蛋白质组（为了避免冗余，考虑了单个iMet处理的蛋白质组）。

  3. 周转值的分布显示了dbTIS与aTIS蛋白质组整体稳定性的差异。

图6
图6。N末端蛋白质组可能表现出不同的稳定性

  1. AIMP2、MARE2、AN32E dbTIS和aTIS蛋白质组的降解谱是稳定性不同的N末端蛋白质组的代表性示例。

  2. 源于氨酰-tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白2（AIMP2）的两种蛋白质组的N末端的MS光谱：一个带有加工iMet的dbTIS指示N末端，起始于第二个氨基酸Pro，一个起始于位置3并保持其iMet不变的aTIS指示肽。从质谱图中可以明显看出，这些N末端蛋白质组显示出很大程度上不同的周转率。

  3. 计算100个dbTIS和aTIS蛋白质组对的周转时间差异，并按升序排列。每对中N末端截断的程度用颜色编码，以可视化缺乏氨基酸的数量和周转转移方向之间的相关性缺失。

  4. 对于许多dbTIS/aTIS对，可以观察到aTIS和dbTIS蛋白质组之间的无序含量增加。

图7
图7。N端氨基酸同一性和50%周转率之间的关系

  1. 所有蛋白质N末端根据其N末端残基的身份进行分组，并按稳定性的升序排序。

  2. 蛋氨酸加工通常会影响N末端显示的回转半径较小的氨基酸（第二个位置的S、A、T、C、V、G或P残基）。虽然这些N末端的大多数都经历了蛋氨酸裂解，但一些（部分）保留了它们的第一个氨基酸。随后，iMet处理的N末端可由NatA按照以下效率顺序（S、A、T、C、V和G）进行Nt乙酰化，但P始终保持不变（Van Damme等, 2011). 对于S、A、T、C、G和P起始的N末端，iMet处理的N末端的稳定性非常相似，但其保留iMet的对应物总体上具有更高的稳定性，尤其是MT和MV N末端。与蛋氨酸加工相比，N-乙酰化敏感性似乎对蛋白质组的稳定性没有影响*范围体内Van Damme描述了Nt‐乙酰化等(2011).

  3. 以S、A、T、C、G和P开头的N末端及其iMet保留对应物计算的周转时间差异（47个具有有效周转测量值的蛋白质组对）。可以观察到加工的N端稳定性降低，尤其是T端和V端启动的N端。

图EV4
图EV4。含有泛素化赖氨酸的周转值分布(N个=348）和非泛素化dbTIS公司指示性N端子(N个 = 388)
图8
图8。蛋白质周转量的比较pSILAC公司和瑞士法郎‐追逐
  1. A类

    用100μg/ml CHX处理Jurkat细胞0、0.5、1.5、4、8、12或24小时。蛋白质降解通过Western blotting进行监测，并使用抗体（包括层粘连蛋白B、安全蛋白、β-连环蛋白、GCIP相互作用蛋白p29）和稳定蛋白（如GAPDH和肌动蛋白）来确认几种短寿命内源性蛋白的稳定性。蛋白质组特异性带用于计算蛋白质半衰期，该半衰期与从pSILAC获得的周转时间吻合良好

  2. B、 C类

    验证由dbTIS和aTIS衍生的MARE2和AN32E蛋白质组的不同周转时间。选择性C末端V5标记的蛋白质组在HCT116细胞中过度表达24小时，并按照Jurkat细胞的描述进行CHX脉冲追踪实验。通过抗-V5抗体监测过表达蛋白质组的降解，并与肌动蛋白和微管蛋白等稳定蛋白质的周转进行比较。

可在线获取此图的源数据。
图EV5
图EV5。硅烷Jurkat细胞的标记
Jurkat细胞常规培养RPMI公司培养基被转移到RPMI SILAC公司含有Arg的介质6 我精氨酸并培养7天。随后，细胞被转移到RPMI SILAC公司含有Arg的介质0 我精氨酸，以实现完全脱标。通过量化识别的微软使用吉祥物蒸馏器的光谱。
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