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.2016年2月15日6:21526。
doi:10.1038/srep21526。

活性氧介导感染活结核分枝杆菌巨噬细胞波形蛋白的下调

P P马赫什 1, R J雷特纳库马尔 1, 萨蒂什·蒙代尔 1
附属公司

活性氧介导感染活结核分枝杆菌的巨噬细胞中波形蛋白的下调

P P马赫什等。 科学代表. .

摘要

结核分枝杆菌主要存在于感染后的巨噬细胞中，并操纵宿主的防御途径。2D凝胶电泳结果显示，与感染热灭活结核分枝杆菌H37Rv的巨噬细胞相比，感染活结核分枝菌H37Rv的巨噬细胞中的中间丝蛋白波形蛋白下调。Western blot和定量RT-PCR证实下调。此外，在无毒菌株结核分枝杆菌H37Ra感染的巨噬细胞中，波形蛋白的表达与热灭活的H37Rv感染的巨噬细胞相似。H2O2处理的活H37Rv感染巨噬细胞中波形蛋白的表达增加，NAC和DPI处理的热杀H37Rv感染巨噬细胞中的波形蛋白表达降低，表明活性氧正调控波形蛋白。巨噬细胞中ESAT-6的异位表达降低了ROS水平和波形蛋白的表达，这意味着结核分枝杆菌介导的波形蛋白下调至少部分是由于病原菌对ROS的下调。有趣的是，巨噬细胞与抗波形蛋白抗体的孵育增加了活性氧的产生，并降低了H37Rv的存活率。此外，我们还表明，PKA/PKC对巨噬细胞中波形蛋白的磷酸化模式与单核细胞不同，强调了波形蛋白磷酸化在巨噬细胞分化中的作用。

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数字

图1
图1。波形蛋白被活的H37Rv下调。
(一)巨噬细胞单层被活的H37Rv感染，热灭活的H27Rv和未感染的巨噬细胞作为对照。2DE在24小时后完成 感染后h，考马斯蓝显示。箭头指向被MALDI-TOF-TOF选中并随后确定为vimentin的点。该实验是两个具有类似结果的独立实验的代表。(b条)qRT-PCR是使用从未感染的巨噬细胞和感染热灭活或活的巨噬细胞中分离的RNA进行的结核分枝杆菌H37Rv，12 感染后h，以GAPDH为参考基因。与热灭活的H37Rv感染巨噬细胞或未感染巨噬细胞相比，感染H37Rv的活巨噬细胞中波形蛋白的表达降低。值表示为平均值 ± 东南部，n = 3，*平均差异在0.05水平上显著。(c（c）)用活的H37Rv、热灭活的H27Rv和H37Ra感染巨噬细胞单层。12之后 h感染的不同样品进行蛋白质印迹。β-微管蛋白作为负荷对照。与热灭活的H37Rv感染巨噬细胞、H37Ra感染巨噬细胞和未感染巨噬细胞相比，感染H37Rv的活巨噬细胞中波形蛋白的表达降低。值表示为平均值 ± SE，n个 = 3.*平均差异在0.05水平上显著。
图2
图2。单核细胞和巨噬细胞中波形蛋白的分布。
(一)波形蛋白（红色）染色的THP1单核细胞和巨噬细胞的免疫荧光清楚地显示了它们之间的分布差异(b条)左侧面板显示PKA底物抗体下拉免疫沉淀的Western blot。PKA/PKC磷酸化了单核细胞和巨噬细胞中波形蛋白的分子大小形式，表明磷酸化蛋白约为53 KDa仅存在于诱导的巨噬细胞中。右侧面板显示2DE实验中总波形蛋白的Western blots，显示靠近53的两个斑点簇 kDa和25 单核细胞和巨噬细胞中的kDa形式；53号附近的斑点群 与单核细胞相比，由于磷酸化，巨噬细胞中的kDa左移至酸性更强的pI。
图3
图3。波形蛋白下调结核分枝杆菌与病原体对巨噬细胞的抗炎作用有关。
(一)巨噬细胞单层被活H37Rv感染。用H处理感染的巨噬细胞2O（运行）2在100 μM和TNFα在10 ng/ml，4后 吞噬作用h。未感染的巨噬细胞在1 12μg/ml后 感染后h，对所有样本进行Western印迹处理，并用抗波形蛋白抗体进行检测；β-微管蛋白作为负荷对照。活分枝杆菌减少波形蛋白的表达，并通过H2O（运行）2和TNFα。LPS增加波形蛋白，用作阳性对照。值表示为平均值 ± 东南部，n = 3，*平均差异在0.05水平上具有显著性。(b、 c（c）)巨噬细胞单层感染热灭活的H37Rv。感染的巨噬细胞在10时用NAC治疗 mM，50时PDTC 500时为μM，G \6983 nM和DPI（10时） μM，4之后 吞噬作用h。12之后 感染后h，对所有样本进行Western印迹处理，并用抗波形蛋白抗体进行检测；β-微管蛋白作为负荷对照。值表示为平均值 ± 东南部，n = 3，*平均差异在0.05水平上显著。(d日)24天后，与热灭活的感染H37Rv的巨噬细胞相比，感染H37R病毒的活巨噬细胞中的ROS水平降低 感染h。值表示为平均值 ± 东南部，n = 4和p = 0.03.
图4
图4。ESAT-6下调ROS水平和波形蛋白表达。
用含有ESAT-6的质粒或对照质粒转染THP1细胞，并用PMA处理形成巨噬细胞。(一)与对照组相比，表达ESAT-6的巨噬细胞中以DCFDA荧光测定的ROS水平降低。值表示为平均值 ± 东南部，n = 9.*平均差异在0.05水平上显著。(b条)与对照组相比，表达ESAT-6的巨噬细胞中波形蛋白的表达降低。值表示为平均值 ± 东南部，n = 3.*平均差异在0.05水平上显著。
图5
图5。抗波形蛋白抗体治疗巨噬细胞可提高ROS水平和杀伤结核分枝杆菌。
用抗波形蛋白抗体或正常IgG处理未感染的巨噬细胞单层，并用DCFDA荧光测定ROS。(一)第6页 h；n个 = 8，页 = 0.005和(b条)24时 h；n个 = 第7页 = 0.004. (c（c）)巨噬细胞单层被H37Rv感染，吞噬后用抗波形蛋白抗体或正常IgG处理。24天后 感染后h，裂解细胞，稀释至10−2和电镀；n个 = 8，页 = 0.034之间。值表示为平均值 ± SE.CFU检测表明，抗波形蛋白抗体治疗可减少活H37Rv的数量。
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