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.2016年12月；55(12):2183-2195.
doi:10.1002/mc.22460。 Epub 2016年2月9日。

苔藓抑素类似物Merle23对小鼠表皮细胞和皮肤的生物活性

杰西卡·凯尔西 1, 克里斯托夫·卡塔松 1, 陈金秋 2, 米歇尔·埃尔曼 2, 马克·彼得森 三, 大卫·O·鲍曼 三, 凯文·麦高文 三, 斯图亚特·H·尤斯帕 1, 加里·凯克 三, 彼得·布隆伯格 1
附属公司

苔藓抑制素类似物Merle 23对小鼠表皮细胞和皮肤的生物活性

杰西卡·凯尔西等。 摩尔癌. 2016年12月.

摘要

Bryostatin 1是一种复杂的大环内酯，是多种癌症化疗临床试验的对象。尽管苔藓抑制素1的生化功能与经典的小鼠皮肤肿瘤启动子佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）一样，结合并激活蛋白激酶C，但矛盾的是，它未能诱导许多典型的佛波醇酯反应，包括促癌反应。目前正在进行大量的合成工作，以开发简化的苔藓抑制素类似物，以保留苔藓生长抑制素1的关键功能特征，包括其缺乏促肿瘤活性。bryostatin类似物维持bryostatin1独特生物行为模式的程度取决于特定的细胞系统和特定的反应。Merle 23是一种显著简化的苔藓抑制素类似物，仅在有限程度上保留了苔藓生长抑制素样活性。在这里，我们表明，根据检测的具体参数，Merle 23在小鼠表皮细胞中的活性要么类似于bryostatin 1，要么介于bryostatin1和PMA之间。然后我们检测了Merle 23对小鼠皮肤的增生和肿瘤促进活性。Merle 23表现出明显减少了增生，并且在与PMA剂量相当的剂量下不促进肿瘤生长。这些结果表明，苔藓抑制素类似物的设计可能具有很大的灵活性，但其缺乏促肿瘤活性。©2016威利期刊公司。

关键词：梅尔23；项目管理局；苔藓抑制素；小鼠表皮细胞；皮肤癌；促进肿瘤生长。

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数字

图1。
图1。
苔藓抑制素1和Merle 23的结构。阴影框表示bryostatin 1和Merle 23之间的差异区域。
图2。
图2。
小鼠原代角质形成细胞对PMA、bryostatin 1和Merle 23的形态学反应。将原代角质形成细胞暴露于PMA、bryostatin 1、Merle 23（均为100 nM）或溶媒对照（DMSO，0.1%），并在接下来的72小时内使用培养基监测其形态和汇合。按照所示的间隔拍摄图像，并使用Incucyte软件自动计算汇流范围。（A） 显示了指定时间点的单元格代表性图像。比例尺代表100μm。（B） 汇流百分比是以时间为函数绘制的。点表示三个独立实验的平均值±SEM。
图3。
图3。
PMA、bryostatin 1和Merle 23对PKC信号传导和下调的影响。用指定浓度的PMA、bryostatin 1和Merle 23处理原代角质形成细胞。然后制备裂解液并通过免疫印迹法进行分析。（A） 配体处理15分钟后，测定S299处PKCδ的磷酸化。结果代表了三个独立的实验。（B） 治疗24小时后测定PKC亚型的下调。给出了具有代表性的实验。每个实验进行三次。D、 二甲基亚砜。
图4。
图4。
暴露于PMA、bryostatin 1和Merle 23的角质形成细胞中促炎介质的基因表达变化。（A） 在指定的时间内，用100 nM PMA（红线）、bryostatin 1（蓝线）或Merle 23（黑线）处理原代角质形成细胞。提取RNATnfa、Ccl20、Cxcl1、Il36a、Tgfa、和伊尔1a通过定量PCR检测其表达。（B） Tgfa，伊利诺伊36a、和伊尔1a根据PMA指示浓度的处理，在处理6小时后测定苔藓抑制素1和Merle 23。数值表示A中的时间点和B中的浓度的至少三个独立实验的结果，但A中的24小时时间点以及B中的0.1 nM、300 nM和3000 nM点除外，它们代表两个独立实验。*表示意义(P（P）<0.05）。
图5。
图5。
角质形成细胞对PMA、bryostatin 1和Merle 23的反应释放细胞因子和趋化因子。用DMSO或所示nM浓度的PMA、苔藓蛋白1和Merle 23处理角质形成细胞24小时。然后使用磁性Luminex分析系统测量分泌到培养基中的指示细胞因子和趋化因子的水平。结果显示了三次试验的平均值±SEM。在每个实验中，将结果标准化为该实验中检测到的细胞因子或趋化因子的最大水平。D、 二甲基亚砜；P、 项目管理局；M、 梅尔23；B、 苔藓抑制素1.*表示意义(P（P）<0.05）或**(P（P）< 0.005).
图6。
图6。
PMA和Merle 23对表皮增生的影响。每周用0.2 ml丙酮或0.2 ml丙酮中规定量的PMA或Merle 23对SENCAR小鼠进行一次治疗，持续4周。在最后一次治疗后，对小鼠实施安乐死，并从治疗后的皮肤制备组织切片。（A） 代表性图像。比例尺代表100μm。（B） 不同治疗组表皮厚度的定量。每个治疗组有三只小鼠。从每只老鼠身上制备一个切片，并对每个切片进行40次厚度测量。在B中，*表示重要性(P（P）<0.05）与丙酮处理的小鼠相比。使用摩尔单位的剂量为：PMA，0.83，1.7，3.3，8.3 nmol；梅尔23、0.040、0.13、0.40、1.3、4.0、13、40毫摩尔。
图7。
图7。
Merle 23作为肿瘤促进剂和PMA促进抑制剂的检测。用5μg（20 nmol）DMBA启动SENCAR小鼠，然后用丙酮、PMA（2μg；3.3 nmol）、Merle 23（0.2μg，2μg，0.26，2.6 nmol）或Merle 23。对于另一组服用Merle 23（2μg；2.6 nmol，第3组）的患者，省略了最初的DMBA治疗。每周在0.2 ml丙酮中涂抹化合物30周。发病率是指携带一个或多个乳头状瘤的小鼠的百分比。平均肿瘤负担是乳头状瘤总数除以小鼠数量。如果符号不可见，则它们位于基线。横线表示每只小鼠乳头状瘤数量的SE。第4组和第5组的发病率差异无统计学意义（Kaplan–Meier检验P（P）=0.28）。第4组和第5组之间每周形成的肿瘤数量差异略高于统计显著性阈值(P（P）=0.052，Mann–Whitney试验）。
图8。
图8。
评估Merle 23对小鼠表皮的局部活性。将PMA（2μg，0.6μg，2μg；3.3，1.0，0.33 nmol）或Merle 23（2μg/0.6μg/0.2μg；2.6，0.79，0.26 nmol）放入0.2 ml丙酮中或单独使用丙酮治疗SENCAR小鼠2 h。每个治疗组包括7只小鼠。通过免疫印迹法评估（A）cFos和（B）Egr1的表达，并显示印迹定量。AU（任意单位）。条形代表平均值±SEM。*表示显著性(P（P）<0.05）与丙酮处理的小鼠相比。（C） 免疫印迹、单个通道代表单个小鼠的裂解物。为了校正凝胶之间的绝对强度差异，将结果标准化为每个凝胶上的强度控制。
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