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.2016年3月15日；133(11):1081-92.
doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.115.019357。 Epub 2016年2月3日。

Tbx20在成年心肌细胞中的过表达促进心肌梗死后的增殖并改善心功能

福丽祥 1, 郭敏哲 1, 凯瑟琳·尤兹 2
附属公司

心肌梗死后成人心肌细胞过度表达Tbx20促进增殖和改善心功能

福丽祥等。 循环. .

摘要

背景：成年哺乳动物心肌细胞（CMs）具有增殖的潜能，但这不足以在心肌梗死（MI）后产生足够的CMs。转录因子Tbx20是CM在发育和成年CM稳态期间增殖所必需的。检测Tbx20过表达（Tbx20（OE））促进成人CM增殖和改善MI后心脏功能的能力。

方法和结果：Tbx20（OE）在成年小鼠分化的CM中被特异性诱导。与对照组相比，Tbx20（OE）心脏在基线检查时的CM增殖和胎儿样特征增加，但在4周后未引起病理学改变。此外，心肌梗死后成年CM患者的Tbx20（OE）显著改善了存活率、心功能和心肌梗死4周后的梗死面积。与对照组相比，在Tbx20[OE]心脏的MI边缘区观察到CM增殖和毛细血管密度增加，表明心脏修复得到改善。与基线和心肌梗死条件下的对照组相比，Tbx20（OE）心脏中增殖激活物（细胞周期蛋白D1、E1和IGF1）和胎儿收缩蛋白（ssTNI、βMHC）mRNA的表达增加，而阴性细胞周期调节物（p21、Meis1）的表达降低。成人心脏中的Tbx20（OE）激活了多种增殖途径，包括Akt、YAP和BMP。有趣的是，p21、Meis1和一种新的细胞周期抑制基因Btg2直接被Tbx20.结合和抑制，从而诱导新生儿CM的增殖。

结论：Tbx20（OE），特别是在成年CM中，激活多种心脏增殖途径，直接抑制细胞周期抑制基因p21、Meis1和Btg2，促进成年CM增殖；保持心肌梗死后的心脏功能。

关键词：细胞周期；分子生物学；心肌梗死；心肌细胞，心脏；再生。

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数字

图1
图1
Tbx20塔布运行经验成年心肌细胞的诱导。A） Tbx20小鼠的产生运行经验成人CMCAG-CAT-Tbx20型(ccTbx20码)本研究展示了用于三苯氧胺（Tamoxifen，TAM）诱导成年小鼠进行三次手术或心肌梗死（MI）的转基因和实验设计。B） 通过western分析确定心脏Tbx20的表达。C） DTG和STG小鼠的心脏切片用抗Tbx20抗体进行DAB染色。STG心脏CM中观察到Tbx20的正常低水平核表达（细胞核棕色染色）。TAM治疗4周后，在DTG心肌中观察到CMs细胞核中特异性的Tbx20表达增加（暗箭头）。D） DTG；ROSA公司毫微克用小鼠验证Tbx20的效率和CM-特异性基因诱导运行经验老鼠。DTG心脏切片；ROSA公司毫微克在单次TAM注射（TAMX1）或每天注射3次TAM（TAMX3）后2周，小鼠出现GFP-阳性CMs（绿色）。无Cre介导重组的非CM表达番茄（红细胞，箭头）。比例尺=100μm。个别数据点显示为中位数和四分位数范围。使用未配对的Mann-Whitney U检验确定统计显著性：*P（P）与STG相比<0.05。N=6。
图2
图2
CM-特定Tbx20运行经验诱导成年小鼠在无损伤的情况下促进CM增殖体内.A）pHH3的代表性Z堆栈共焦图像+TAM诱导4周后，假手术DTG心肌出现CM。红色：pHH3；绿色：α-肌动蛋白；蓝色：Hoechst；白色：WGA。α-肌动蛋白显示的绿色条纹证实了CM-的一致性。B） pHH3的百分比+用pHH3（红色）和α-肌动蛋白（绿色）联合染色标记DTG心脏和STG心脏中的CM/总CM。C） 图中显示了异常操作DTG心肌中Aurora B激酶（ABK）阳性CM的典型Z堆栈共焦图像。红色：ABK；绿色：α-肌动蛋白；蓝色：赫斯特。D） 显著增加ABK+与STG相比，DTG心脏中发现了CMs。E） 从左心室组织中分离出mRNA。通过qRT-PCR检测DTG中胎儿收缩蛋白、细胞周期激活剂和抑制剂的表达，并将STG（虚线）设置为1.0。F） 游离CM的总数（x105)在TAM诱导4周后，测定STG和DTG小鼠的每心重。比例尺=10μm。数据点显示为中位数和四分位范围。使用未配对的Mann-Whitney U检验确定统计显著性：*P（P）与STG相比<0.05。N=6。
图3
图3
CM-特定Tbx20运行经验促进孤立成人巨细胞瘤的增殖和胎儿样特征增加。在TAM诱导4周后，从成年STG和DTG小鼠中分离出CMs，并培养6-8小时。A） 分化的纹状体CMs用α-肌动蛋白（绿色）染色。与STG相比，DTG CM的小区面积更小。比例尺=100μm。B） 与STG相比，DTG心脏中单核成年CM的百分比显著增加，而双核CM的百分比下降。C） 图中显示了由核pHH3（红色）、Hoechst（蓝色）和α-肌动蛋白（绿色条纹）标记的具有代表性的成人条纹CM。pHH3的百分比+与STG-CM相比，在隔离DTG中量化CM/总分化CM。比例尺=10μm。D） pHH3百分比+在单核和双核CM中测定CM/总CM。E）通过western分析测定βMHC和ssTnI蛋白的表达，并相对于GAPDH表达进行量化。F） 通过qRT-PCR相对于设置为1.0的STG（虚线）检测分离DTG-CM中胎儿收缩蛋白、细胞周期激活剂和抑制剂的mRNA表达。个别数据点显示为中位数和四分位数范围。使用未配对的Mann-Whitney U检验确定统计显著性：*P（P）与STG相比<0.05。N=4。
图4
图4
CM-特定Tbx20运行经验心肌梗死后诱导的心肌梗死保留了心脏功能，提高了损伤后4周的存活率。2个月大的STG和DTG小鼠接受MI或假手术，然后在术后3天内注射TAM以诱导Tbx20运行经验在DTG中。A） 术后4周通过超声心动图测量心功能。显示了典型的M模式跟踪图像。箭头表示左心室舒张（LVIDd）和收缩（LVIDs）内径。B） 测量STG、DTG假手术组和MI组的部分缩短（FS）。C–E）术后4周通过Millar导管测量心功能（收缩功能为C、Pmax、D、+dP/dt；舒张功能为E、−dP/dt）。个别数据点显示为中位数和四分位数范围。使用Kruskal-Wallis检验和Bonferroni校正确定统计显著性：*P（P）<0.05 vs.假手术；†P（P）<0.05 vs.STG MI.N=8只小鼠/组。F） 监测心肌梗死后7~28天的存活率。使用Log-rank（Mantel-Cox）检验确定统计显著性：*P（P）与STG MI相比<0.05。
图5
图5
CM-特定Tbx20运行经验心肌梗死后诱发的瘢痕缩小，心肌肥厚减轻，心肌毛细血管密度升高。A） 显示了来自STG和DTG MI心脏的用Masson三色蓝染色的连续横截面的代表性图像。蓝色染色是疤痕区域。比例尺=1mm。B） 心肌梗死后4周量化梗死疤痕大小。使用非配对Mann-Whitney U检验确定统计显著性：*P（P）与STG相比<0.05。C） 显示梗死边缘区和假心肌中WGA染色（红色）的典型CM横截面图像。比例尺=50μm。心肌梗死后4周，DTG相对于STG心脏的横截面CM面积（D）明显更小，HWT/BWT（E）更低。图中显示梗死边缘区和假心肌CD31（PECAM）染色（红色）的代表性图像。比例尺=50μm。G） 心肌梗死后4周，DTG心肌边缘区的毛细血管密度高于STG。个别数据点显示为中位数和四分位数范围。使用Kruskal-Wallis检验和Bonferroni校正确定统计显著性：*P（P）<0.05 vs.假手术；†P（P）与STG MI.N=6-8相比，<0.05。
图6
图6
CM-Tbx20的特异性诱导运行经验MI促进损伤后CM增殖。pHH3的代表性图像+显示STG（A）和DTG（B）心肌梗死边缘区的CM。比例尺=100μm。方框表示a1、a2、b1、b2区域，具有pHH3的高清晰度图像+细胞。比例尺=10μm。红色：pHH3；绿色：α-肌动蛋白；蓝色：Hoechst；白色：WGA。pHH3+a1和a2中的细胞是非CM细胞，在WGA染色定义的边界内不表达α-肌动蛋白。pHH3+如WGA定义的细胞内α-肌动蛋白的共同染色所示，b1和b2中的细胞正在增殖CM。显著增加pHH3+与心肌梗死（C）后4周的STG相比，DTG心脏的边缘和边远区域发现了CM。Aurora B激酶染色也用于识别循环CM+/α-肌动蛋白+与心肌梗死（D）后4周的STG相比，DTG心脏边缘区存在CM。使用Kruskal-Wallis检验确定统计显著性，然后进行Bonferroni校正：*P（P）与偏远地区相比<0.05；†P（P）与STG相比<0.05。E） 用qRT-PCR相对STG（虚线）设置为1.0检测DTG小鼠边缘区促血管生成因子、细胞周期激活物和阻遏物的mRNA表达。使用未配对的Mann-Whitney U检验确定统计显著性：*P（P）与STG相比<0.05。N=6。个别数据点显示为中位数和四分位数范围。
图7
图7
Btg2型Tbx20的抑制足以诱导CM增殖。A） 的表达式Btg2型Tbx20中的mRNA运行经验通过qRT-PCR确定接受假手术或MI的DTG心脏相对于设置为1.0的STG（虚线）。B） 通过western blot分析测定STG和DTG假手术心脏中Btg2蛋白的表达。N=5-6。使用非配对Mann-Whitney U检验确定统计显著性：*P（P）与STG相比<0.05。C） 用干扰siRNA（siScramble）、Tbx20 siRNA（SiTbx20siRNA）、Btg2 siRNA（SiBtg2）或siTbx20-SiBtg2转染P0小鼠CMs。48小时后，CMs用pHH3（红色）和α-肌动蛋白（绿色）染色。箭头表示pHH3+；α-辅肌动蛋白+CM.比例尺=50μm。D） pHH3的百分比+α-辅肌动蛋白+/总α-肌动蛋白+与siScramble相比，siTbx20-转染siBtg2-的P0-CM中的CMs减少，但增加。siBtg2对Btg2表达的抑制挽救了siTbx20治疗的CM.E的增殖下降。）细胞周期蛋白D1与siScramble（设置为1.0）相比，mRNA在siTbx20中显著下调，但在siBtg2转染的培养物中上调。F）p21基因与siScramble相比，siTbx20-转染siBtg2-P0-CM的mRNA显著增加，但降低（设为1.0）。N=6个独立实验。个别数据点显示为中位数和四分位数范围。使用Kruskal-Wallis检验确定统计显著性，然后进行Bonferroni校正：*P（P）与siScramble相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.siTbx20。
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