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.2016年1月29日；11（1）：e0148219。
doi:10.1371/journal.pone.0148219。 2016年eCollection。

Ndufs4（KO）小鼠大脑呼吸能力的区域特异性缺陷

恩斯特·伯恩哈德·凯泽 1, 玛格丽特·塞登斯基 1 2, 菲利普·摩根 1 2
附属机构

Ndufs4（KO）小鼠大脑呼吸能力的区域特异性缺陷

恩斯特·伯恩哈德·凯泽等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：NDUFS4是线粒体复合物I（NADH：泛醌氧化还原酶）的一种亚单位，缺乏NDUFS4会导致Leigh综合征（LS），这是一种进行性脑肌病。敲除Ndufs4，无论是系统性还是仅在大脑中，都会在小鼠中引发LS。在患者和KO小鼠中，尽管存在系统性复合物I功能障碍，但大脑不同区域退化，而周围组织存活。为了理解疾病的病因并最终开发LS的合理治疗方法，揭示局灶性神经变性的机制似乎很重要。

结果：在这里，我们使用Ndufs4（KO）小鼠来研究大脑呼吸能力的区域和时间差异是否与神经退行性变相关。在KO中，来自易变性区域的突触体的呼吸能力显著降低，如嗅球、脑干和小脑。即使在出现神经症状之前，这种差异也是可以测量的。此外，未发现突触体糖酵解能力的补偿或加剧变化。相比之下，KO在抗退化/有弹性的大脑“休息区”保持接近正常水平的突触体呼吸。我们还研究了非突触体线粒体。KO通过复杂的I依赖性底物组合丙酮酸/苹果酸和谷氨酸/苹果酸酯降低了氧化磷酸化（状态3呼吸）的能力，但令人惊讶的是，KO具有与α-酮戊二酸/苹果酯正常的活性。氧化磷酸化（丙酮酸/苹果酸驱动的状态3呼吸）与神经退行性变之间没有相关性：值得注意的是，状态3在KO中保持不变，而在对照组中，随着时间的推移，状态3趋于增加，导致老年小鼠在脆弱脑区和弹性脑区的基因型之间存在显著差异。区域活性氧损伤（以HNE修饰蛋白测量）和区域复合物I稳定性（以蓝色天然凝胶评估）都不能解释区域神经变性。

结论：我们的数据表明，神经末梢局部呼吸能力不足可能导致局灶性神经变性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。分离（非突触）线粒体氧化磷酸化的复合物I依赖性能力。
（A） 用复杂的依赖于I的电子供体底物刺激全脑线粒体的最大ADP刺激呼吸（状态3）。值得注意的是，虽然在以谷氨酸/苹果酸为动力的对照组中，随着年龄的增长，牛血清磷容量的增加仅达到统计显著性，但在所有底物和所有基因型的集合中变得显著（三元方差分析P<0.001）。（B，C，D）从脑干（BS）、小脑（CB）和大脑剩余部分（R）分离的线粒体的状态3呼吸。复合物I依赖的电子供体底物为丙酮酸+苹果酸（B）、谷氨酸+苹果酸酯（C）和α-酮戊二酸+苹果酯（D）。嗅球不包括在全脑和R制剂中。*表示霍尔姆对多个成对比较进行校正后的显著差异（α=0.05）。
图2
图2。在有弹性的“休息”大脑的KO线粒体中，复合物I的稳定性没有增加。
脑干（BS）和“静息”脑（R）线粒体蛋白的蓝色天然PAGE在保持野生型线粒体超复合物完整的条件下进行电泳（A）。紫色黄递酶活性染色显示带含有复合物I（黑色箭头）的NAD结合位点。所有蛋白质均未经考马斯蓝（Coomassie blue）特异性反染水蓝色。选定的标志性带被标记为：包含复合物I III和IV（I III IV）的超复合物、不完全超复合物（I III）、孤立复合物I（I）、ATP合成酶（V）、复合物I的低分子量片段（I fgmt）。（灰色箭头处的强黄递酶活性可能是二氢脂酰胺DH）。密度测定结果（B）：所示含复合物I条带的活性染色与复合物V条带的蛋白质染色进行了标准化（用作内部负荷控制）。
图3
图3。大脑区域和年龄组分离的非突触线粒体的氧化磷酸化能力（状态3呼吸）。
A： 在KO中，丙酮酸和苹果酸的复杂I依赖状态3呼吸随着年龄的增长保持不变，但在对照组中趋于增加，导致老年KO小鼠在所有受试脑区的能力显著不足：脑干（BS）、小脑（CB）和除嗅球（R）以外的大脑其余部分。B： 随着鱼藤酮阻断复合物I依赖性电子传递，通过复合物II的状态3呼吸能力在对照组中随着年龄的增长而增加，在CB和R中达到显著水平。生物复制次数在栏中注明。*表示Holm-Bonferroni多重比较校正后显著性水平（α=5%）的显著变化。
图4
图4。与未受影响的对照组相比，KO脆弱区域的HNE对线粒体蛋白的损伤没有增加。
利用线粒体蛋白的Western blot检测由活性氧引发的脂质过氧化反应产物HNE引起的共价修饰。通过对整个车道的密度测定来评估整体损坏。将数据归一化为每个印迹上的参考样品。请注意，KO的易变性区域脑干（BS）和小脑（CB）的损伤并不超过对照组相应区域的损伤。*表示Holm Bonferroni校正后α=5%水平的显著差异。
图5
图5。突触体的代谢能力。
A： 用葡萄糖和丙酮酸为突触体加燃料，通过与原核细胞FCCP解偶联使线粒体呼吸最大化。氧消耗率（OCR）根据非线粒体耗氧量进行校正。注意，KO的易退化区域：嗅球（OB）、脑干（BS）和小脑（CB），而不是大脑的弹性“休息”区域（R），其呼吸能力明显低于对照组。B： 糖酵解能力评估为用4-氨基吡啶阻断氧化磷酸化和刺激ATP转换后测量的外部酸化速率（ECAR）。注意，对于任何给定的大脑区域，糖酵解能力在基因型和年龄之间都相当稳定。观察到的唯一显著变化（α=5%）是小脑对照组（*）随年龄的增长而减少。生物重复的数量在栏中注明。*表示多重比较中Holm-Bonferroni校正后的显著差异（α=5%）。
图6
图6。突触体制剂中突触体和线粒体的标记。
同时用免疫印迹法检测突触素（红色）和ATP酶-α（绿色）。示例（A）显示了基因型和年龄组各组合的3个独立脑干（BS）突触体制剂的印迹。对另外14个斑点（未显示）进行评估，以覆盖该区域和其他大脑区域的样本。每个印迹上都有相同的“休息”脑（R）突触体准备（参考）用于正常化。突触素（B）和ATP酶-α（C）的密度测定结果：将每个带的信号归一化为来自同一印迹的参考信号。数据为平均值±SD，N=3个独立的生物样品，每个样品有3个技术重复。
图7
图7。HNE对KO脆弱区域突触体蛋白的损伤不超过对照组。
通过SDS-PAGE Western blots检测HNE反应产物，评估ROS对突触体的损伤。以12个独立脑干样本的印迹（A）为例。（全套见补充S3图。）标记了3条最具免疫反应活性的带的位置（HNE），显示53kD带的一条未知带为主要反应产物。非特异性条带（非特异性）与一级抗体无关。所有脑区的密度测定结果（B）：对于每个样本，53kD信号均归一化为参考样本（“Ref”），每个印迹上都有相同的等分样本。生物复制次数在每个栏的底部注明。*表示多重比较中Holm-Bonferroni校正后的显著差异（α=5%）。
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这项工作得到了西雅图儿童研究所种子基金和西北线粒体研究协会的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。