A study to identify and characterize the stem/progenitor cell in rabbit meniscus

doi:10.1007/s10616-016-9949-2

.2016年10月；68(5):2083-103.

doi:10.1007/s10616-016-9949-2。 Epub 2016年1月28日。

兔半月板干/祖细胞的鉴定和特性研究

何晃¹, 王淑奎（Shukui Wang）², 桂建超¹, 海奇申^三

附属公司

¹中国江苏省南京市长乐路68号南京医科大学南京第一医院骨科，邮编210006。
²南京医科大学南京第一医院中心实验室，南京，210006，中国。
^三中国江苏省南京市长乐路68号南京医科大学南京第一医院骨科，邮编210006。gary060212@gmail.com。

PMID： 26820973
预防性维修识别码： PMC5023581
内政部： 2007年10月10日/10616-016-9949-2

兔半月板干/祖细胞的鉴定和特性研究

何晃等。细胞技术. 2016年10月.

.2016年10月；68（5）：2083-103。

doi:10.1007/s10616-016-9949-2。 Epub 2016年1月28日。

作者

何晃¹, 王淑奎（Shukui Wang）², 桂建超¹, 海奇申^三

附属公司

¹中国江苏省南京市长乐路68号南京医科大学南京第一医院骨科，邮编210006。
²南京医科大学南京第一医院中心实验室，南京，210006，中国。
^三中国江苏省南京市长乐路68号南京医科大学南京第一医院骨科，邮编210006。gary060212@gmail.com。

PMID： 26820973
预防性维修识别码： PMC5023581
内政部： 2007年10月10日/10616-016-9949-2

摘要

无血管区半月板的修复仍然是一个巨大的挑战，主要是因为它们的愈合能力有限。基于干细胞的组织工程因其多向分化潜能为受损半月板提供了一种有前景的治疗选择。我们假设半月板衍生基质细胞（MMSCs）可能存在于半月板组织中，如果能够确定其多能性和特性，它们可能在半月板愈合中发挥作用。为了验证我们的假设，我们从兔子身上分离出MMSC、骨髓源性基质细胞（BMSC）和纤维软骨细胞。为了避免骨髓间充质基质细胞污染，切除半月板的参数化组织和血管区。通过形态学、集落形成、增殖、免疫细胞化学和多分化鉴定了这三种细胞的特性。此外，在兔半月板中央创面，分析BMSCs和MMSCs对损伤半月板愈合的影响。BMSCs和MMSCs表达干细胞标记物SSEA-4、Nanog、nucleostemin和STRO-1，而纤维软骨细胞不表达这些标记物。形态学上，MMSCs显示出比普通纤维软骨细胞更小的胞体和更大的细胞核。此外，已证实MMSCs和BMSCs在体外均能分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。然而，在填充MMSCs的受伤半月板中发现软骨形成比填充BMSCs的损伤半月板更多。我们发现，兔半月板具有独特的细胞群MMSCs，具有普遍的干细胞特征，并有向软骨细胞分化的趋势。未来的研究应该研究MMSC的机械生物学，并探索使用MMSC更有效地修复或再生损伤半月板的可能性。

关键词：骨髓间充质干细胞；软骨发生；区别；纤维软骨细胞；半月板源性间充质干细胞；间充质基质细胞。

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数字

图1
半月板源性干细胞（MMSCs）的集落形成和集落定量分析。一第15天，用甲基紫染色法在5个T25烧瓶中的一个烧瓶中检测MMSCs集落。b条——**（f）**在T25烧瓶中培养的兔半月板衍生干细胞中，从形态学上观察到五种不同的集落类型(b条,**c（c）**,**e（电子）**)或96-well板(d日,**（f）**).克尽管与第1代相比，第5代培养的菌落数量有所减少，但仍观察到大量菌落。小时每个菌落经胰蛋白酶处理后分别计数细胞数（显微镜放大倍数：×4）(酒吧50微米）

图2
培养中MMSCs和纤维软骨细胞的形态以及MMSCs的FACS分析。一MMSCs在融合培养基中培养时呈鹅卵石状。b条纤维软骨细胞在融合培养中高度伸长，这是一种典型的成纤维细胞或软骨细胞样表型。**c（c）**即使在第5代培养，MMSCs仍保持鹅卵石状。d日CD31、CD34和CD45的最大阳性计数小于2%，然而，大部分MMSCs（>40%）表达CD44、CD90、CD105和CD73（显微镜放大倍数：×20）(酒吧50微米）

图3
MMSCs和纤维软骨细胞的增殖分析。一开始培养MMSCs和纤维软骨细胞，细胞数量为1.5 x 104个/孔。细胞培养9天，用细胞仪计数细胞数。在培养的第5、7和9天，MMSCs的生长显著高于纤维软骨细胞。b条纤维软骨细胞的群体倍增时间（小时）高于MMSC的群体倍增时间（小时），表明MMSC的增殖速度快于纤维软骨细胞(**P（P）* < 0.05)

图4
干细胞标记物SSEA-4、Nanog和nucleostemin的表达。一,d日,克MMSCs分别表达高水平的干细胞标记物SSEA-4、Nanog和nucleostemin。插图显示了三个干细胞标记阳性染色的放大视图。b条,**e（电子）**,小时纤维软骨细胞上未检测到SSEA-4、Nanog和nucleostemin的表达。**c（c）**,**（f）**,我与MMSCs一样，BMSCs也高水平表达这三种干细胞标记物（显微镜放大倍数：×20）(酒吧50微米）

图5
三种细胞干细胞标记物的表达。所有三种干细胞标记物，即CD44、CD90和Strol-1在MMSCs中均强烈表达(一,d日,克)和BMSC(**c（c）**,**（f）**,我)而在纤维软骨细胞中表达较弱(b条,**e（电子）**,小时). 此外，造血干细胞标记CD34和白细胞标记CD45均未在三种细胞中表达(j个——o个)（显微镜放大倍数：×20）(酒吧50微米）

图6
干细胞标志物和胶原相关基因表达的qRT-PCR分析。MMSC和BMSC均表现出两种干细胞标记基因（Nanog和Oct-4）的高表达，而与纤维软骨细胞相比，胶原蛋白相关基因的表达显著降低(**P（P）* < 0.05). 注意，对于实时RT-PCR分析，基因表达水平归一化为GAPDH，至少从三个独立实验中获得

图7
MMSCs、纤维软骨细胞和BMSCs中干细胞标记物的蛋白表达。显然，干细胞标记物CD105、CD90、CD73和SSEA4在MMSCs和BMSCs中均呈强表达，但在纤维软骨细胞中呈弱表达。请注意，我们的数据被归一化为GAPDH，并从至少三个独立实验中获得

图8
分化细胞的组织化学染色和成脂、成骨和成软骨标记基因表达的qRT-PCR分析。与BMSCs类似，MMSCs能够分化为脂肪细胞(一,**c（c）**)，骨细胞(d日,**（f）**)和软骨细胞(克,我)如脂滴、蛋白多糖和钙沉积在细胞表面所示。然而，没有发现纤维软骨细胞表现出这种多分化潜能(b条,**e（电子）**,小时).j个与BMSCs相比，MMSCs显示软骨生成基因标记物（包括II型胶原和Sox9）的表达最高(**P（P）* < 0.01). 然而，BMSCs表达了三组中最高水平的成骨基因标记物，如骨钙素和Runx-2(**P（P）* < 0.01). 成脂基因标志物的表达无明显差异。注意，基因表达水平相对于自己的对照进行了标准化，这些对照是从至少三个独立实验中获得的（显微镜放大倍数：×20）(酒吧50微米）

图9
软骨样组织的形成和切片的阳性染色。一,b条当在成软骨诱导培养基中培养时，MMSCs在10天时逐渐积累并开始在塑料板中形成大的聚集体。**c（c）**,d日细胞从培养皿的边缘卷起聚集在一起，最后收缩成软骨样团块，周围没有任何其他细胞。**e（电子）**培养皿中形成软骨样颗粒。**（f）**——小时Alcian蓝、甲苯胺蓝和藏红O染色明显发现富含蛋白聚糖基质，分别显示蓝色和红色信号。我如II型胶原的免疫染色所示，颗粒中已形成软骨样组织(*红色条纹*).j个H&E染色显示，大量MMSCs迁移至软骨样组织，并形成许多胶原束（显微镜放大倍数：×20）(酒吧50微米）。（在线彩图）

**图10**
兔半月板修复培养6周。在直径为1mm的兔半月板上制作伤口，用BMSCs或MMSCs填充，并用10%FBS-DMEM培养6周。将修复后的半月板切割成10μm的切片，并用Alcian蓝染色(一,b条)、固绿和藏红O(**c（c）**,d日)和胶原蛋白II(**e（电子）**,**（f）**). 伤口充满MMSC(b条,d日,**（f）**)比填充骨髓基质干细胞的快得多(**P（P）* < 0.05)

**图11**
兔半月板修复培养6周。在兔半月板上形成直径为1mm的伤口，该伤口填充有兔骨髓干细胞（BMSC；一,d日,克,j个)或兔半月板干细胞（MMSCs；b条,**e（电子）**,小时,k个)用10%FBS-DMEM培养6周。半月板被切成10μm的切片，并用甲苯胺蓝染色(一,b条)，藏红O(d日,**e（电子）**)、固绿和藏红O(克,小时)，阿尔西安蓝(j个,k个). MMSCs治疗兔半月板90%以上的创面愈合，与BMSCs治疗相比，只有80%愈合(**c（c）**,**（f）**,我,我). 填充MMSCs的伤口愈合速度比填充BMSCs的快得多(**P（P）*<0.05）

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