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.2016年3月15日；129(6):1260-70.
doi:10.1242/jcs.179978。 Epub 2016年1月27日。

使用基于细胞的分析区分骨料形成和骨料清除

伊芙琳·伊恩杰斯 1, 乔安娜·M·德拉吉奇 2, 哈姆·H·坎平加 三, 山本爱 4
附属公司

使用基于细胞的分析区分骨料形成和骨料清除

伊芙琳·伊恩杰斯等。 细胞科学杂志. .

摘要

泛素化蛋白内含物的积累是一个复杂的过程，反映了聚集物形成和聚集物清除之间的不平衡。虽然减少聚集形成或增加聚集清除最终会减少聚集负担，但就疾病发病机制而言，不同的方法可能会产生不同的结果。使用一种新的基于细胞的分析方法，可以区分新形成的内含物和预制的内含物，我们证明了两种先前参与膨胀聚谷氨酰胺内含物自噬清除的蛋白质，即HspB7和Alfy（也称为WDFY3），实际上会影响非常不同的细胞过程，从而影响聚集负荷。使用这种基于细胞的分析，我们还确定，鉴于并非所有聚集物都可用于降解，聚集蛋白的组成性表达可以明显减缓蛋白质聚集物的消除。因此，这项新的分析不仅可以确定改性剂可能影响骨料负荷的步骤，还可以用于提供蛋白质聚集体降解靶向的新见解。

关键词：自噬；伴侣；多谷氨酰胺蛋白；蛋白质聚集。

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作者声明没有竞争或财务利益。

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图1。
图1。
当17aaHtt103Q–mCFP瞬时转染时，HspB7或Alfy的过度表达导致不溶性polyQ蛋白数量减少。HeLa细胞与17aaHtt103Q–mCFP和Alfy（AlfyC）（B）的HspB7（A）或FLAG标记的C末端（2461–3526）结构共同转染。样品在24小时制备 转染后h。使用FTA（i，ii）分析样品中的洗涤剂不溶性蛋白质。每个样品从高到低分为三倍稀释液，如三角形所示。对最高浓度的密度测量进行了量化。通过免疫印迹法（iii，iv）确认可溶性蛋白水平和样品装载量。用抗GFP抗体检测17aaHtt103Q–mCFP蛋白。文丘林被用作密度测定定量的负荷控制。（A） HspB7共表达。（i，ii）FTA定量显示，HspB7过度表达显著降低洗涤剂不溶性17aaHtt103Q–mCFP蛋白水平（含103Q）[F类(1,4)=46.989; *P（P）=0.0024]. （iii，iv）Western blot分析也显示HspB7的过度表达导致SDS-soluble polyQ蛋白的少量增加[F类(1,4)=16.685*P（P）=0.0150]. （B） AlfyC联合表达。（i，ii）FTA显示AlfyC的共同表达导致洗涤剂不溶性103Q蛋白的数量显著减少[F类(1, 4)=61.670; *P（P）=0.0014]. （iii，iv）免疫印迹显示AlfyC对SDS-soluble polyQ蛋白的量没有影响[F类(1,4)=0.061;P（P）=0.8172]. 数据表示为平均值+标准差n个=3个独立实验。进行双尾方差分析以确定统计显著性。Ctrl，空向量。
图2。
图2。
AlfyC而非HspB7的过度表达导致稳定表达的polyQ细胞系中预制17aaHtt65Q聚集体的数量减少。（A） 将AlfyC转染到表达17aaHtt65Q–mCFP的稳定细胞系中。稳定的细胞系在没有dox的情况下保持不变，因此持续表达。FTA（i，ii）和western blotting（iii，iv）样品在72 h后转染(n个=3). AlfyC减少洗涤剂不溶性聚集蛋白的含量[F类(1, 4)=55.902; *P（P）=0.0017]（i，ii）；但对SDS可溶性17aaHtt65Q无影响[F类(1 ,4)=0.063;P（P）=0.8137]（iii，iv）。（B） 在与A相同的条件下转染HspB7，24天后制备FTA（i，ii）样品(n个=4), 48 (n个=4）或72(n个=转染后3小时，24小时后进行western blot分析（iii，iv）(n个=3), 48 (n个=3）或72(n个=转染后2）小时。两者都表明HspB7对SDS不溶性的量没有影响[F类(1, 16)=0.539;P（P）=0.4734]或SDS可溶[F类(1,10)=0.670;P（P）=0.4321]17aaHtt65Q–mCFP蛋白质。Western blotting也显示HspB7蛋白在72 转染后h。（v，vi）基于图像的分析还表明，HspB7不影响含有17aaHtt103Q–mCFP聚集体的细胞百分比（绿色）[F类(1, 6)=0.366;P（P）=0.5672]. 细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。每个实验复制计数100个细胞(n个=2). 数据表示为上述独立实验数量的平均值+s.d。比例尺：10 微米。进行双尾方差分析以确定统计显著性。Ctrl，空向量。
图3。
图3。
诱导型Exon1Htt103Q–HaloTag细胞系在给予dox后表现出聚集清除。（A） EM48免疫荧光（绿色）证实TMR阳性聚集物（红色）代表聚集的外显子1Htt103Q–HaloTag。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。（B） 时间线概述了实验设计。稳定的细胞系保持在“开”状态。在时间0时，细胞暴露于0.5μM TMR中30分钟，然后暴露于多西环素（dox）。在分析之前（0小时）以及24、48、72和96小时后，将细胞暴露于1.5 mM俄勒冈州绿（OG）中30分钟，以标记新形成的外显子1Htt103Q–HaloTag蛋白。（C，D）时间0、48和96的代表性图像（C）和量化（D） 用1治疗后h μg/ml dox。检查TMR（红色）和俄勒冈州绿（绿色）通道，发现没有可检测到的俄勒冈州绿染色。对两个通道中检测到的所有聚集物进行量化后发现，当表达被取消时，72天后聚集物就不再可检测 h.几乎没有发现可检测到的Oregon-Green阳性结构，TMR-阳性聚集物基本被清除。数据表示为平均值+标准差n个=4个独立实验。每个时间点平均计数1000个细胞。比例尺：10 微米。
图4。
图4。
外显子1HTT103Q–HaloTag聚集体以溶酶体依赖的方式清除。（A） FTA（i，ii）和western blotting（iii，iv）用于研究外显子1Htt103Q–Halotag（103Q-HT或HT）蛋白的清除。用抗HaloTag抗体探测膜。（i，ii）洗涤剂不溶性外显子1Htt103Q–48天后无法检测到HaloTag蛋白 h.根据图3，这表明基于图像的分析可能对该细胞系的清除率分析更敏感。（iii，iv）Western blot分析表明，洗涤剂可溶性蛋白质在24小时内被清除 h.（B）Exon1Htt103Q–HaloTag细胞暴露于1 µg/ml dox，不含或含10 溶酶体抑制剂氯喹（Chlor）48μM h.通过FTA（i，ii）或western blotting（iii）分析样品。氯的存在显著阻碍了洗涤剂不溶性蛋白质的清除[F类（2，6）=214.395, *P（P）=0.0015]. 溶酶体抑制不会延迟可溶性外显子1Htt103Q蛋白的清除[F类（2，6）=2578.875，P（P）=0.8616]. LC3 II（LC3的脂化形式）的积累意味着自噬体成熟减弱，证实溶酶体受到抑制。（C） Exon1Htt103Q–HaloTag与GFP–LC3在初级神经元中共定位。将GFP–LC3转基因小鼠产生的初级皮层神经元瞬时转染外显子1Htt103Q–HaloTag，并暴露于TMR 24 h之后。数据表示为平均值+标准差n个=3个独立实验。比例尺：10 微米。进行双尾方差分析以确定统计显著性。
图5。
图5。
Exon1Htt103Q–HaloTag细胞系可用于监测polyQ蛋白持续存在下的聚集物形成、生长和清除。（A） 实验设计示意图。细胞暴露于0.5 30μM TMR（红色） 分钟。在收集之前，在指定的时间，细胞也暴露在俄勒冈州绿（OG，绿色）中30 最小值（B–D）代表图像[在0 h（B）、24、48、72和96 TMR或俄勒冈州绿色阳性聚集物的h（C）]和量化（D）。白框中高亮显示的区域在相应图像下方以较高的放大倍数显示。细胞显示，在外显子1Htt103Q–HaloTag的持续表达过程中可能发生聚集清除。在0 h所有聚集物均为TMR阳性，几乎没有检测到Oregon-Green阳性结构。随着时间的推移，会有一个逐渐的转变，即96年之后 h大多数TMR阳性聚集体被清除，并且对俄勒冈州绿色呈阳性。（E，F）在连续表达的条件下，两种不同的HaloTag配体的聚集体可以是阳性的。（E） 香豆素阳性聚集体的代表性图像，该聚集体继续生长并包含新的TMR-阳性外显子1Htt103Q–HaloTag蛋白。24 香豆素后h，给予TMR标记该新表达蛋白。（F） 对D中表示的数据进行重新分析，以包括TMR-only、TMR和Oregon Green双阳性和Oregon-Green-only聚集体，结果表明，TMR-only-聚集体寿命很短，要么被清除，要么继续结合蛋白质。到96年 h、 大多数含TMR的聚集物都被消除了，并且大多数只对俄勒冈州绿区呈阳性。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。数据表示为平均值±标准差n个=4个独立实验。每个时间点平均计数1000个细胞。比例尺：10 微米。
图6。
图6。
HspB7抑制新聚集物的形成，而AlfyC刺激不再生长的聚集物的清除。Exon1Htt103Q–HaloTag细胞被HspB7或AlfyC及其各自的Ctrl（空载体）转染。交换转染介质后，细胞暴露于TMR（红色）以标记预先存在的蛋白质。48至72之后 h、 添加Oregon Green（OG）标记新表达的蛋白质，然后分析细胞的TMR-only、TMR和Oregon Green双阳性和Oregon-Green-only阳性结构。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。（A–C）HspB7转染细胞。（A） 代表性图片48 Ctrl或HspB7转染后h。白色框中高亮显示的区域在相应图像下方以较高的放大倍数显示。（B） 仅对TMR、俄勒冈州绿色双阳性和俄勒冈山绿色聚集物进行量化，并将其归一化为Ctrl。与图2B类似，HspB7不会减少聚集体的总数[F类(1,10)=0.024;P（P）=0.8800]，因为HspB7不会影响预先存在的（仅TMR）和生长的（TMR和俄勒冈州绿）骨料的数量[F类(1,10)=4.224;P（P）=0.697和F类(1,10)=1,149;P（P）分别=3.090。]。然而，HspB7过度表达导致Oregon-Green-only聚集体显著减少[F类(1,10)=12.247; *P（P）=0.0057]，表明HspB7影响新聚集物的形成。（C） 不同聚合阶段如何在总数中表示的图形表示。与图5一致，大多数骨料为TMR和Oregon Green双阳性，其次为TMR，然后为Oregon Green。因此，尽管HspB7对Oregon-Green-only聚集体有影响，但对存在的聚集体总数没有显著影响。（D–F）AlfyC转染细胞。（D） 代表性图片72 Ctrl或AlfyC转染后h。（E） 仅TMR、TMR和Oregon Green双阳性和Oregon-Green聚集物的量化归一化为Ctrl。与图2A类似，AlfyC减少了骨料的总数[F类(1,10)=32.595;P（P）=0.0002]. 这种减少是由于仅TMR和Oregon-绿色骨料的显著减少[F类(1,10)=71.548;P（P）<0.0001和F类(1,10)=11.111；P（P）分别=0.0076]。AlfyC的存在对TMR和Oregon Green双正增长集料没有影响[F类(1,10)=2.054;P（P）=0.1823]. （F） 不同骨料阶段如何在骨料总数中表示的图形表示。数据表示为平均值+标准差n个=6个独立实验。每个时间点的平均细胞数为750个。比例尺：10 微米。进行双尾方差分析以确定统计显著性。不另作统计分析，无统计学意义。
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