Targeted delivery of human iPS-ECs overexpressing IL-8 receptors inhibits neointimal and inflammatory responses to vascular injury in the rat

doi:10.1152/ajpheart.00587.2015

.2016年3月15日；310（6）：H705-15。

doi:10.1152/ajpheart.00587.2015年。 Epub 2016年1月22日。

靶向递送过度表达IL-8受体的人iPS-EC抑制大鼠血管损伤的新生内膜和炎症反应

附属公司

¹阿拉巴马大学伯明翰分校医学系心血管疾病科血管生物学和高血压项目；
²伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学医学院肺、危重病护理、睡眠和过敏科；
^三阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学系心血管疾病科血管生物学和高血压项目；阿拉巴马州伯明翰市伯明翰退伍军人事务医疗中心心脏科；
⁴德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所；
⁵加利福尼亚州斯坦福大学心血管内科；
⁶加利福尼亚州斯坦福大学心血管研究所；加利福尼亚州帕洛阿尔托退伍军人事务帕洛阿尔多医疗保健系统；和。
⁷加利福尼亚州斯坦福大学心血管研究所；加利福尼亚州帕洛阿尔托退伍军人事务帕洛阿尔多医疗保健系统；加州斯坦福大学心胸外科。
⁸阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学系心血管疾病科血管生物学和高血压项目；yfchen@uab.edu。

PMID： 26801304
预防性维修识别码：项目经理4865064
内政部： 10.1152/ajpheart.00587.2015

靶向递送过度表达IL-8受体的人iPS-EC抑制大鼠血管损伤的新生内膜和炎症反应

萨曼莎·佐丹诺等。美国生理学杂志心脏循环生理学. 2016.

.2016年3月15日；310（6）：H705-15。

doi:10.1152/ajpheart.00587.2015年。 Epub 2016年1月22日。

附属公司

¹阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学系心血管疾病科血管生物学和高血压项目；
²伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学医学院肺、危重病护理、睡眠和过敏科；
^三阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学系心血管疾病科血管生物学和高血压项目；阿拉巴马州伯明翰市伯明翰退伍军人事务医疗中心心脏科；
⁴德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所；
⁵加利福尼亚州斯坦福大学心血管内科；
⁶加利福尼亚州斯坦福大学心血管研究所；加利福尼亚州帕洛阿尔托退伍军人事务帕洛阿尔多医疗保健系统；和。
⁷加利福尼亚州斯坦福大学心血管研究所；退伍军人事务Palo Alto医疗保健系统，加利福尼亚州Palo Alto；加州斯坦福大学心胸外科。
⁸阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学系心血管疾病科血管生物学和高血压项目；yfchen@uab.edu。

PMID： 26801304
预防性维修识别码：项目经理4865064
内政部： 10.1152/ajpheart.00587.2015

摘要

白细胞介素-8（IL8）在多种疾病的损伤动脉中高度表达，是中性粒细胞的化学引诱剂，中性粒细胞在其膜上表达IL8受体IL8RA和RB（IL8RA/B）。中性粒细胞与受损的内皮细胞相互作用，并在损伤部位引发炎症级联反应。我们利用腺病毒载体在人诱导多能干细胞（HiPS-IL8RA/B-ECs）衍生的内皮细胞（EC）表面过度表达IL8RA/B和绿色荧光蛋白（GFP），为急性血管损伤创造了一种新的翻译靶向细胞治疗方法。我们假设，将HiPS-IL8RA/B-ECs静脉输注到颈动脉球囊损伤的大鼠体内，将靶向损伤部位并与中性粒细胞竞争，从而抑制炎症和新生内膜的形成。年轻成年雄性Sprague-Dawley大鼠行右颈动脉球囊损伤，腔内损伤后立即静脉输注生理盐水、1.5×10（6）HiPS-ECs、1.5×10~Null-ECs或1.5×10~（6）HiPS-IL8RA/B-ECs。采用新型GFP DNA qPCR方法分析HiPS-IL8RA/B-ECs的组织分布。分别用ELISA和免疫组织化学方法检测损伤动脉和未损伤动脉中细胞因子和趋化因子的表达及白细胞浸润。在损伤后14天测量新生内膜、内侧区和再内皮化。HiPS-IL8RA/B-ECs定位于损伤的动脉，抑制炎症介质表达和炎症细胞浸润，加速再内皮化，减轻腔内损伤后新生内膜的形成，而对照组HiPS-ECs和HiPS-Null-EC则没有。将HiPS-IL8RA/B-ECs输注到颈动脉腔内损伤的大鼠体内，靶向损伤的动脉，为治疗血管损伤提供了一种新的策略。

关键词：内皮细胞；人诱导多能干细胞；炎症性血管损伤；再狭窄；靶向细胞治疗；血管损伤。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
A类：腺病毒转导人诱导多能干细胞-内皮细胞（HiPS-ECs），并在转导的HiPS-EC中过度表达白细胞介素8受体A（IL8RA）和受体B（IL8RB）。明亮的视野(*Aa1类*)和荧光显微照片(*Aa2类*)在用携带IL8RA或RB基因（HiPS-IL8RA/B-ECs）和绿色荧光蛋白（GFP）基因的腺病毒转导48小时后，从人诱导多能干细胞（HiPS-ECs。*抗体1*和*第二抗体*：HiPS-Null-EC是用带有GFP基因的空（空）腺病毒转导的HiPS-EC。转导后90%以上的细胞GFP阳性（转导效率>90%）。B类：HiPS-IL8RA/B-EC在体外向IL8迁移。采用Boyden双腔技术评估HiPS-IL8RA/B-ECs、HiPS-Null-EC和HiPS-ECs（无腺病毒转导）对IL8的体外迁移活性。将含有IL8梯度浓度的底部培养箱和顶部培养箱中的单层内皮细胞培养12 h。将HiPS-ECs向不同浓度IL8的基线迁移率绘制为1(x个-轴（对数刻度）。结果为平均值±SE#对与各自未翻译的HiPS-EC组（开环）相比，<0.05*对与各自的HiPS-Null-EC组（闭合圈）相比，<0.05。

**图2。**
无论有无腺病毒IL8RA/B转导，IL8RA和RB在HiPS-EC中的表达。A类：荧光显微照片显示HiPS-IL8RA/B-EC中IL8RA的表达（红色，用IL8RA一级抗体免疫染色）(*a1级*)、HiPS-Null-EC(*b1号机组*)和HiPS-EC(*c1级*)（无转导）腺病毒转导后48h。*a2类*,*b2型*、和c2：DAPI染色*a1级*,*b1号机组*、和*c1级*分别是。*a3类*,*b3层*、和*c3（立方厘米）*：IL8RA和DAPI的合并图像。B类：显示HiPS-IL8RA/B-EC中IL8RB表达的荧光显微照片(*a1级*)、HiPS-Null-EC(*b1号机组*)和HiPS-EC(*c1级*)腺病毒转导后48h。*a2类*,*b2型*、和c2：DAPI染色*a1级*,*b1号机组*、和*c1级*分别是。*a3类*,*b3层*、和*c3（立方厘米）*：IL8RB和DAPI的合并图像。

**图3。**
vWF和CD31在有或无腺病毒IL8RA/B转导的HiPS-EC中的表达。A类：显示vWF（绿色，用vWF一级抗体免疫染色）在HiPS-IL8RA/B-ECs中表达的荧光显微照片(*A1类*)、HiPS-Null-EC(*地下一层*)和HiPS-EC（C1)（无转导）腺病毒转导后48h。*A2类*,*地下二层*、和*指挥与控制*：DAPI染色*A1类*,*地下一层*、和*C1类*分别是。*A3号*,*地下三层*、和*C3类*：分别合并vWF和DAPI的图像。B类：荧光显微照片显示HiPS-IL8RA/B-EC中CD31的表达（红色，CD31一级抗体免疫染色）(*A1类*)、HiPS-Null-EC(*地下一层*)和HiPS-EC(*C1类*)腺病毒转导后48h。*A2类*,*地下二层*、和*指挥与控制*：DAPI染色*A1类*,*地下一层*、和*C1类*分别是。*A3号*,*地下三层*、和*C3类*：分别合并CD31和DAPI的图像。

**图4。**
*Aa1类*：在HiPS-IL8RA/B-EC输注后30分钟，对受伤的右颈动脉（RCA）进行共聚焦表面显微镜成像，显示GFP+细胞附着在受伤的右颈动脉管腔表面。*Aa2类*：相位对比显微照片，显示GFP+细胞在*Aa1类*在管腔内表面上。B类，顶面板：损伤后24小时RCA和未损伤LCA中EC的CD31（EC标记）免疫染色。蓝色箭头表示未受损的左颈动脉（LCA）内皮完整（棕色染色）。B类，底部面板：受伤后24小时RCA和未受伤LCA中HiPS-IL8RA/B-EC的GFP免疫染色。黑色箭头表示受损RCA外膜中的GFP+细胞（棕色染色）。医学、媒体；Adv，外膜。C类：在RCA球囊损伤大鼠静脉输注HiPS-IL8RA/B-ECs或HiPS-Null-ECs 24 h后，使用GFP-DNA实时qPCR技术进行体内追踪。LCA被用作未受损伤的对照。GFP DNA水平被用作受损RCA或未受损LCA中HiPS-Null-EC或HiPS-IL8RA/B-ECs累积的指标。车辆对照组（不输EC）作为背景信号对照。在相同的实时qPCR中测量GFP和GAPDH DNA水平。GFP DNA水平通过GAPDH DNA标准化，然后标准化为受损颈动脉的平均DNA水平。结果为平均值±SE#对与各自的HiPS-Null-EC组相比，<0.05*对与相应的LCA对照组相比，<0.05。

**图5。**
HiPS-IL8RA/B-EC或HiPS-EC输血对中性粒细胞或单核细胞/巨噬细胞浸润损伤RCA或未损伤LCA的影响。中性粒细胞密度(A类)和单核细胞/巨噬细胞(B类)受伤后24小时RCA或未受伤LCA的外膜。B类，顶面板：4组不同大鼠外膜中性粒细胞[用髓过氧化物酶（MPO）抗体免疫染色]或单核细胞/巨噬细胞（用ED1抗体免疫染色）的代表性显微照片。B类底部：在每条血管的6个横切面上计数MPO或ED1阳性细胞数。未受伤+载具组为对侧LCA，无球囊损伤。损伤+溶媒组为接受RCA球囊损伤但未接受细胞输注的大鼠的RCA。受伤+HiPS-IL8RA/B-EC组静脉输注EC（1.5×10⁶细胞/大鼠）损伤后立即过度表达IL8RA/B。受伤+HiPS-EC组在未经腺病毒转导的情况下静脉输注内皮细胞。结果为平均值±SE；n个=容器数量#对与未受伤+车辆对照组相比，<0.05*对与受伤+车辆对照组相比，<0.05。

**图6。**
HiPS-IL8RA/B-ECs或HiPS-ECs输注对损伤后24小时RCA和未损伤LCA中趋化因子和粘附分子mRNA或蛋白水平的影响，以及对细胞输注。A类和B类：损伤和细胞输注后24小时，受损RCA或未受损LCA中CINC-2β（细胞因子诱导中性粒细胞趋化因子-2-β，相当于人IL8）和MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）的mRNA水平。通过实时qRT-PCR测量整个血管中的CINC-2β和MCP1 mRNA水平，并使用18S RNA水平进行标准化，以校正总RNA负载量的差异。在CINC-2βmRNA RT-qPCR中，随机排除两个损伤+载体组和两个损伤+HiPS-IL8RA/B-EC组的样本。白细胞介素1-β（IL-1β）；C类)血管内皮生长因子（VEGF）；D类)调节活化，正常T细胞表达和分泌（RANTES；E类)和白细胞介素10（IL-10；F类)使用多重ELISA试剂盒测量整个血管中的蛋白质水平。结果为平均值±SE；n个=容器数量#对与未受伤+车辆对照组相比，<0.05*对与受伤+车辆对照组相比，<0.05。

**图7。**
颈动脉损伤后28天，受损RCA或未受损LCA的新生内膜形成。A类：球囊损伤后28天，接受或不接受HiPS-ILRA/B-EC或HiPS-EC输血（损伤后立即）的大鼠受损RCA和未受损LCA的代表性H/E染色横截面。以输注HiPS-EC的大鼠作为对照。B类,C类、和D类：量化损伤RCA损伤后28天的新生内膜与中膜比率、中层面积和新生内膜面积。结果为平均值±SE；n个=大鼠数量#对与未受伤+车辆对照组相比<0.05*对与受伤+车辆对照组相比，<0.05。

**图8。**
HiPS-IL8RA/B-EC输血对大鼠受损颈动脉再内皮化的加速作用。A类：球囊损伤14天后分离大鼠颈总动脉。大鼠解剖前用伊文思蓝（EB）染料灌注。损伤的右颈总动脉从主动脉弓切至内外颈动脉分叉处。完整的内皮细胞不包括埃文斯蓝染料。B类：通过埃文斯蓝染色技术评估受伤RCA的再矿化百分比。%再内皮化=（颈总动脉长度减去蓝色区域长度）/颈总动脉总长度×100。结果为平均值±SE；n个=大鼠数量。采用单因素方差分析对数据进行分析*对与其他3个对照组相比，<0.05。载体对照组为RCA损伤但未输EC的大鼠。

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