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.2016年1月22日16:6。
doi:10.1186/s12896-0106-0238-0。

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系表观遗传学和转录异质性的机制

纳塔莉·维思 1, 霍尔格·齐尔 2, 罗德里克·麦克劳德 3, 斯特拉·玛丽·雷蒙·布埃特纳 4
附属公司

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系表观遗传和转录异质性的机制

纳塔莉·维思等。 BMC生物技术. .

摘要

背景：用于生产治疗性抗体的重组细胞株在长期培养过程中经常出现不稳定性或失去重组蛋白表达。细胞系亚克隆之间的异质基因表达可能是由DNA或组蛋白（染色质的蛋白质成分）的表观遗传修饰引起的。因此，我们在整合到中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系基因组中的抗体蛋白表达载体中，沿着人类真核生物翻译延伸因子1α1（EEF1A1）启动子，在这些细胞系中研究了DNA甲基化和染色质环境。

结果：我们分析了四个PT1-CHO细胞系，它们在贴壁条件下和含有10%FCS的培养基中生长的高级传代数（>P35）时出现蛋白质表达缺失。通过荧光原位杂交（FISH）和定量PCR（qPCR）分别测定，这些细胞株表现出不同的整合位点和转基因拷贝数。通过qRT-PCR，我们分析了重组mRNA的表达，并将其与DNA甲基化以及通过各种方法询问EEF1A1启动子区域染色质景观的结果相关联。每个PT1-CHO细胞系都显示出与重组mRNA表达相关的特定表观遗传特征或染色质标记。重组mRNA表达最低的细胞系（PT1-1）的特点是核小体占有率最高，与活性转录相关的组蛋白标记富集最低。相反，具有最高重组mRNA表达（PT1-55）的细胞系显示出最高数量的甲醛辅助分离调节元件（FAIRE）富集区，并以组蛋白修饰物H3K9ac和H3K9 me3富集为标志。另一种具有第二高重组mRNA转录和最稳定蛋白表达（PT1-7）的细胞系具有最高的组蛋白变体H3.3和H2A富集度。Z、 组蛋白修饰H3K9ac。另一个细胞系（PT1-30）的二价标记H3K4me3和H3K27me3的富集度最高。最后，DNA甲基化起了作用，但仅在FCS减少的培养基或不同的表达载体中起作用。

结论：我们的结果表明，EEF1A1启动子区域的染色质状态有助于预测重组mRNA的表达，从而有助于在细胞系发育过程中选择合适的克隆以生产蛋白质。

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数字

图1
图1
PT1-CHO细胞系的细胞遗传学特征。一FISH分析显示PT1表达载体在CHO-K1基因组中的不同整合位点。PT1-30可见着丝粒整合位点，PT1-55可见端粒整合位点。在早期传代（P10）重组PT1-CHO细胞系上进行FISH。用DAPI（4′，6-二胺-2′-苯基吲哚二盐酸盐）对制剂进行复染。进行反向DAPI转换以使潜在的G带图像可见。用红色发射Dy-590-dUTP（PT1-7）或绿色发射Dy-495（PT1-1/30/55）通过缺口转换标记所示的载体DNAb染色体数目（即2n个===========================================================================22）在P55代100个中期测定，范围为84%至98%。
图2
图2
PT1-CHO细胞系基因组不稳定性的测定。一DAPI训练后观察到的染色体和染色质异常示例。所示为从PT1-30中看到的内容；用箭头表示：(1)后期染色质桥；(2)后期滞后的染色体；(3)末期微核；(4)在较小的微核旁边有一个微核；(5)核芽；(6)染色质凝聚/断裂。b微核、核芽、染色质凝集和ana/末期异常的频率，显示PT1-1的频率高于其他三种细胞系。微核形成的单向方差分析试验(*P（P）===========================================================================0.0457）和ana/末期异常(*P（P）===========================================================================0.0221）发现显著。细胞生长在单孔室载玻片中。微核、核芽和染色质浓缩/破碎的频率由n个===========================================================================4000个电池。异常有丝分裂期的频率在n个===========================================================================100 ana/末期。数据表示两个通道（P55和P72）测量平均值（SEM）的平均值和标准误差。
图3
图3
重组PT1-CHO细胞系的转基因拷贝数和稳定性研究。一利用PT1构建物早期轻链cDNA上的引物，通过定量PCR（qPCR）测定整合转基因的拷贝数。PT1-7被用作校准品，其已知拷贝数为先前通过Southern blot杂交测定的拷贝数（数据未显示）。样品测量为三份。PT1-30和PT1-55显示了一个以上的转基因拷贝。数据表示平均值和标准误差（SEM）n个===========================================================================3次测量。b以相对值1作为起始滴度值，启动稳定性研究。在研究期间，所有克隆都表现出不同程度的不稳定性。在最不稳定的克隆PT1-1中，测得生产力下降到0.2，而PT1-7的滴度仅下降到0.8。
图4
图4
四种不同PT1-CHO细胞系中的重组mRNA表达：一使用重链（HC）和轻链（LC）引物通过qRT-PCR测定；和bHC/LC qRT-PCR值的百分比。qRT-PCR结果通过绝对定量标准曲线法获得，并作为n个===========================================================================在多个通道（P56至P72）进行8次独立的时间点测量。双向方差分析显著(***P（P） < 0.0001); 曼·惠特尼U型PT1-1与PT1-7、PT1-30或PT1-55的测试（双尾）也很显著(***P（P）===========================================================================0.0002). 数据表示平均值和标准误差（SEM）n个===========================================================================8个独立测量。
图5
图5
DNA甲基化分析EEF1A1型低传代启动子区（P8），但不同浓度的FCS（a：上面板）与0.5%FCS（b：下面板）对细胞系PT1-7与PT1-55。甲基化CpG(填充棒棒糖)，非甲基化CpG(未填充的棒棒糖).
图6
图6
CpG-特异性DNA甲基转移酶的单分子染色质定位M.Sss公司我在EEF1A1型PT1-CHO细胞系中的启动子。一具有假定转录因子结合位点的预测核小体（命名为Nuc 853）的示意性注释(绿色，矩形框)和CpG(灰色，方形盒子). 以下面板具有代表性M.Sss公司PT1-55中获得的地图和解释。甲基化（=未受保护的CpG，红色); 未甲基化（=受保护的CpG，蓝色); 白色方块缺少值或值不清楚。b分析的离TSS最近的核小体和M.Sss公司I地图显示PT1-7中受保护的CpG比PT1-55中更多。
图7
图7
染色质标记与PT1-CHO细胞系中重组mRNA表达相关。一含H2A的ChIP表明核小体占有率较高，而重组mRNA表达较低。结果显示为根据Ct值计算的输入百分比，以及n个===========================================================================12个独立实验，涉及沿着两个预测核小体位置的四对引物EEF1A1型启动子区。还显示了在IgG的四对引物中获得的qPCR值，作为ChIP实验的对照。统计显著性（*，***）P（P） < 0.05，未配对t吨测试，单尾。bH3.3和H3K9ac相对于H2A的富集。c（c）所有分析组蛋白变体（H2A.Z，H3.3）和组蛋白修饰（H3K4me3，H3K27me3，H3Gac，H3K9me3）的ChIP富集总结。数据表示平均值和标准误差（SEM）n个===========================================================================3个独立实验和不同传代分离的染色质（P52–P70）。
图8
图8
通过qPCR测定，在PT1-55中，FAIRE富集（DNA不与蛋白质结合，水相）显示最高。还显示了相应有机相中的回收碎片。使用的底漆如表2所示。数据表示平均值和标准误差（SEM）n个===========================================================================3个独立实验和不同传代分离的染色质（P55、P72、P73）。
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