Design and evaluation of novel interferon lambda analogs with enhanced antiviral activity and improved drug attributes

doi:10.2147/DDDT.S91455

比较研究

.2016年1月6日10:163-82。

doi:10.2147/DDDT。第91455条。电子收集2016。

新型干扰素λ类似物的设计与评价

Debin余¹, 赵明志², 李伟东¹, Lu Zhao先生¹, 邹明伟^三, 和童孙⁴, 张梦莹⁴, 刘洪宇⁴, 邹志华¹

附属公司

¹艾滋病疫苗国家工程实验室、教育部分子酶学与工程重点实验室、吉林大学生命科学学院、长春。
²蛋白质组学国家重点实验室、国家蛋白质药物工程研究中心、北京蛋白质组研究中心、中国北京放射医学研究所。
^三美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿大学人文社会科学学院心理学系。
⁴Prosit Sole生物技术有限公司，中华人民共和国北京。

PMID： 26792983
预防性维修识别码：项目经理4708225
内政部： 10.2147/日。S91455号

比较研究

新型干扰素λ类似物的设计与评价

Debin余等。药物开发治疗. 2016.

.2016年1月6日10:163-82。

doi:10.2147/DDDT。S91455。电子收集2016。

作者

Debin余¹, 赵明志², 董立伟¹, Lu Zhao先生¹, 邹明伟^三, 和童孙⁴, 张梦莹⁴, 刘洪宇⁴, 邹志华¹

附属公司

¹艾滋病疫苗国家工程实验室、教育部分子酶学与工程重点实验室、吉林大学生命科学学院、长春。
²蛋白质组学国家重点实验室、国家蛋白质药物工程研究中心、北京蛋白质组研究中心、中国北京放射医学研究所。
^三美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿大学人文社会科学学院心理学系。
⁴Prosit Sole生物技术有限公司，中华人民共和国北京。

PMID： 26792983
预防性维修识别码：项目经理4708225
内政部： 10.2147/日。S91455号

摘要

III型干扰素（IFNs）（也称为IFN-λ：IFN-∧1、IFN-λs 2、IFN-∧的3和IFN-λ的4）是防御粘膜上皮细胞病毒感染的关键参与者，其中I型干扰物的活性较弱，与I型干干扰素不同的是，I型干衣素具有严重且多样的副作用，III型IFN由于其受体的高度限制性表达而引起的副作用最小，因此似乎是治疗和预防呼吸道和胃肠道病毒感染的有前途的药物。然而，与I型相比，天然III型干扰素的抗病毒效力较弱，尽管IFN-λ3在III型干干扰素中具有最高的生物活性，但由于难以在原核表达系统中表达IFN-∧3，目前正在开发干扰素-λ1，而不是IFN-λ的3作为治疗药物。在这里，为了开发具有改进药物属性的最佳IFN-λ分子，我们设计了一系列IFN-λ类似物，用IFN-∧3对应物替换IFN-∧1的关键氨基酸，反之亦然。设计的四个类似物在大肠杆菌中成功表达，且产量高，易于从包涵体中纯化。有趣的是，所有四个类似物在诱导抗病毒基因MxA和OAS的表达方面都表现出了强大的活性，其中两个类似物-6和-7在激活IFN-刺激反应元件（ISRE）-荧光素酶报告子方面表现出了出乎意料的高效能，高于I型IFN（IFN-α2a）。重要的是，类似物-6和-7都有效地抑制了Huh-7.5.1细胞中丙型肝炎病毒的复制，其IC50与IFN-α2a相当；与IFN-λ在粘膜上皮中的作用一致，这两种类似物都能有效抑制H3N2流感A病毒在A549细胞中的复制。这些研究共同确定了两种干扰素-λ类似物作为开发新型抗病毒生物制剂的候选药物。

关键词：干扰素-λ；IL-28B；IL-29；模拟；抗病毒；III型干扰素。

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数字

图1
干扰素-λ类似物的设计。**注意事项：**(A类)干扰素-λ1（IL-29S）和干扰素/λ3氨基酸序列的比对：保守氨基酸用红色标记，螺旋A–F标记在序列下方，而任意分割的片段A、b、c和d标记在序列上方。(B类)九个类似物的序列结构：干扰素-λ1片段标记为红色，干扰素/λ3片段标记为蓝色。**缩写：**干扰素，干扰素。

图2
表达蛋白的分析和表征。**注意事项：**(A类)SDS-PAGE凝胶分析九种设计类似物的小规模表达：右边的箭头标记预期蛋白带的位置；M：蛋白质标记物；A： IPTG诱导；B：未引入。(B类)从SP HP柱洗脱的类似物-6（左）和PEG-类似物-6的代表性色谱仪（右）。(C类)纯化蛋白（左）和纯化聚乙二醇化蛋白（右）的SDS-PAGE凝胶分析：样品未经变性并在非还原条件下运行。(天)纯化IFN-λ1（IL-29S）（左）和类似物-6（右）的HPLC分析：左边的峰代表聚乙二醇化蛋白，右边的峰代表未修饰蛋白。**缩写：**干扰素；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；聚乙二醇干扰素，聚乙二醇化干扰素；SDS-PAGE，聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图3
抗病毒基因表达的刺激。**注意事项：**(A类–C类)MxA和OAS基因表达的qRT-PCR分析：不同浓度的蛋白质处理细胞12小时，类似物-6、-7、-8和-9诱导MxA与OAS表达，IFN-λ1表现出良好的剂量依赖性(A类); 用10 ng/mL蛋白质处理细胞3、12和24小时，MxA和OAS的诱导表达具有良好的时间依赖性(B类); 用10 ng/mL聚乙二醇化蛋白处理细胞12小时，PEG-类似物-6和PEG-相似物-7表现出与PEG-IFN-λ1和PEG-IFN-α2a相似的诱导活性(C类). (天)STAT1磷酸化的Western blot分析的代表性图像：用10 ng/mL聚乙二醇化蛋白处理细胞12小时。**缩写：**干扰素；聚乙二醇干扰素，聚乙二醇化干扰素；qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应。

图4
激活ISRE-luciferase报告子。**注意事项：**(A类)模拟物-6、类似物-7和干扰素-λ1的代表性响应曲线。(B类)PEG-类似物-6、PEG-相似物-7、PEG-IFN-λ1和PEG-IFN-α2a的代表性响应曲线。使用GraphPad Prism软件分析数据。**缩写：**干扰素；ISRE，干扰素刺激反应元件；聚乙二醇干扰素，聚乙二醇化干扰素。

图5
抗-HCV分析。**注意事项：**(A类)用0、0.5、5和50 ng/mL PEG-类似物-6、PEG-相似物-7、PEG-IFN-λ1或PEG-IFN-α2a处理HCVcc感染的Huh-7.5.1细胞48小时，并用抗HCV核心抗体（绿色，上面板）和DAPI（蓝色，下面板）染色；比例尺：50μm。(B类)HCV阳性细胞的定量：手动计数三个孔中的HCV病灶数量，并显示每个孔中HCV病灶的平均数量。**缩写：**丙型肝炎病毒；干扰素；聚乙二醇干扰素，聚乙二醇化干扰素。

图6
抗-HCV和抗H3N2效力的量化。**注意事项：**(A类)HCV抑制的代表性曲线：HCVcc感染的Huh-7.5.1细胞经PEG-类似物-6、PEG-相似物-7、PEG-IFN-λ1或PEG-IFN-α2a处理48小时，代表相对HCV RNA水平的值拟合到GraphPad Prism软件中，以生成抑制曲线和IC₅₀. (B类)H3N2抑制的代表性曲线：用类似物-6、类似物-7、IFN-λ1或IFN-α2a处理A549细胞24小时，然后感染H3N2-A流感病毒90分钟，72小时后用ELISA定量H3N2-病毒的数量。**缩写：**丙型肝炎病毒；干扰素；酶联免疫吸附试验；集成电路₅₀，半数最大抑制浓度；聚乙二醇干扰素，聚乙二醇化干扰素。

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