Multinucleation and Polykaryon Formation is Promoted by the EhPC4 Transcription Factor in Entamoeba histolytica

doi:10.1038/srep19611

.2016年1月21:6:19611。

doi:10.1038/srep19611。

溶组织内阿米巴EhPC4转录因子促进多核和多核形成

附属公司

¹墨西哥城市自治大学基因组科学项目，墨西哥墨西哥城。
²国家理工学院、国家医学与顺势疗法学院、分子生物医学机构项目、生物技术项目、墨西哥墨西哥城。
^三巴斯德研究所，寄生虫细胞生物学研究所，法国巴黎。
⁴法国巴黎INSERM U786。
⁵墨西哥墨西哥城国家癌症研究所致癌实验室。
⁶墨西哥墨西哥城大都会自治大学自然科学系。
⁷国家理工学院研究与高级研究中心，感染学和分子发病学系，墨西哥墨西哥城。

PMID： 26792358
预防性维修识别码：项目经理4726151
内政部： 10.1038/srep19611

EhPC4转录因子在溶组织内阿米巴中促进多核化和多核体形成

奥尔加·埃尔南德斯·德拉克鲁斯等。科学代表. 2016.

.2016年1月21:6:19611。

doi:10.1038/srep19611。

附属公司

¹墨西哥城市自治大学基因组科学项目，墨西哥墨西哥城。
²国家理工学院、国家医学与顺势疗法学院、分子生物医学机构项目、生物技术项目、墨西哥墨西哥城。
^三巴斯德研究所，寄生虫细胞生物学研究所，法国巴黎。
⁴法国巴黎INSERM U786。
⁵墨西哥墨西哥城国家癌症研究所致癌实验室。
⁶墨西哥墨西哥城大都会自治大学自然科学系。
⁷国家理工学院研究与高级研究中心，感染学和分子发病学系，墨西哥墨西哥城。

PMID： 26792358
预防性维修识别码：项目经理4726151
内政部： 10.1038/srep19611

摘要

溶组织内阿米巴是引起人类阿米巴病的肠道寄生虫，阿米巴病是发展中国家的主要死亡原因。在这种原生动物中，DNA含量的异质性、多倍体和基因组可塑性与控制DNA复制和细胞分裂的机制的改变有关。研究转录因子EhPC4的功能，我们意外地发现它在功能上与DNA复制和多核化有关。FRFPKG基序的定点突变表明，K127残基是有效EhPC4 DNA结合活性所必需的。值得注意的是，EhPC4的过度表达显著增加了滋养体的细胞增殖、DNA复制和DNA含量。此外，还发现细胞大小急剧增加，导致形成巨大的多核滋养体（多核体）。多核事件与胞质分裂失败相关，导致正在进行的细胞分裂流产。一贯地，EhPC4过表达滋养体的全基因组分析揭示了参与碳水化合物和核酸代谢、染色体分离和胞质分裂的基因上调。其中一个基因EhNUDC（核运动蛋白）的强制过表达导致胞质分裂的改变，并部分重述了多核表型。这些数据首次表明EhPC4与溶组织埃希菌的多倍体和基因组稳定性相关事件相关。

PubMed免责声明

利益冲突声明

我声明，作者没有自然出版集团定义的竞争利益，也没有其他可能会影响本文报告的结果和/或讨论的利益。

数字

**图1。EhPC4是一种具有DNA结合活性的进化保守蛋白。**
(A类)人类的分子组织和*溶组织内阿米巴*PC4蛋白。蛋白质示意图（上面板）和人类PC4-CTD（纯色）和EhPC4-CTT（透明色）蛋白质三级结构的叠加（下面板）。在Phyre程序中，以人PC4-CTD（PDB1PCF）的结构为模板，通过同源性推导出EhPC4的三维模型。PDB文件由VMD（Visual Molecular Dynamics）查看器使用。图由O.H.C.绘制(B类)EhPC4中ssDNA结合域与细菌和真核生物中代表性同源蛋白的多重比对。黑箱，相同残留物；灰色盒子，类似残留物。箭头表示FRFPKG基序中最保守的残基。(C类)通过PSI-BLAST分析评估EhPC4和直源蛋白之间的关系。连接线的宽度表示相似度E值作为阈值。(D类)概述寡核苷酸dT之间更具代表性接触的示意图₍₁₈₎EhPC4-CTD二聚体的G和氨基酸残基。红色和绿色残基分别对应于EhPC4-CTD单体链A和链B。星号、赖氨酸残基（K₁₂₇)选择用于突变。(E类)重组EhPC4和EhPC5的表达-K127A蛋白。车道1，非转化细菌提取物；通道2和通道6，非诱导细菌提取物；通道3和7，IPTG诱导的细菌提取物（3 h）；车道4和8，可溶分数（SF）；通道5和9，不溶性分数（IF）。箭头，重组蛋白。(F类)生物素标记培养EhPC4的电泳迁移率变化分析（EMSA）*埃哈德112*启动子片段。1号车道，免费*EhADH112型*探查；泳道2，用EhPC4探针（1μg）；通道3，用EhPC4（1μg）和抗EhPC3抗体（2μg）探针；通道4，抗EhPC4抗体探针；通道5，BSA探针。箭头，DNA-蛋白复合物；星号，DNA-蛋白-EhPC4抗体复合物。(克)通过EMSA比较野生型EhPC4和突变EhPC4-K127A蛋白的DNA结合活性。1号车道，免费*EhADH112型*探查；通道2至5，用野生型EhPC4浓度降低的探针培养（分别为1.0、0.5、0.25和0.125μg/通道）；通道6至9，用EhPC4-K127A浓度降低（分别为1.0、0.5、0.25和0.125μg/通道）培养探针。

**图2。EhPC4过度表达改变细胞增殖和DNA复制。**
(A类)EhPC4总提取物（TE）、核提取物（NE）和细胞质提取物（CE）的免疫检测*溶组织内阿米巴*通过蛋白质印迹分析。通道1至3，抗EhPC4抗体；车道4和车道5，免疫前血清；通道6和7，抗EhCAF1抗体用作对照。(B类)免疫荧光和共聚焦显微镜检测显示EhPC4在滋养体中的细胞定位，使用抗EhPC4+FIT-C结合二级抗体。显示相位对比、DAPI染色、绿色通道（FIT-C）和合并。底部面板，单细胞（放大100倍）。(C类)EhPC4（Alexa 647-共轭二级抗体）与层粘连蛋白B1（Alexa-488共轭二次抗体）的协同免疫定位。比例尺，10 微米。(D类)EhPC4和Lamin B蛋白的Colocalization分析。Mander散点图显示EhPC4（红色）和Lamin B（绿色）荧光信号的像素强度。使用WCIF ImageJ软件进行分析。(E类)通过Western blot分析，使用抗Myc（上面板）和抗EhPC4（下面板）抗体对pKT-3M-EhPC4-转染滋养体中的Myc tagged-EhPC4和内源性EhPC4-proteins进行免疫检测。通道1，未转染细胞；通道2，pKT-3M转染细胞；通道3，pKT-3M-EhPC4转染细胞。(F类)免疫荧光和共焦显微镜分析显示使用抗Myc和Alexa 546结合次级抗体对Myc标记的EhPC4进行细胞定位。pKT-3M（上面板）和pKT-3G-EhPC4（下面板）转染的滋养体显示了相位对比、DAPI染色、绿色通道（FIT-C）和合并。(克)扩散和(**H（H）**)未转染的pKT-3M和pKT-3G-EhPC4转染滋养体的存活率。所示值为三个独立实验的平均值 ± 标准偏差(我)荧光BrdU在未转染的pKT-3M和pKT-3M-EhPC4转染的滋养体中掺入的共聚焦显微镜。绿色通道，Cy2染色。标点线、单元格轮廓。(J型)荧光BrdU信号强度的量化(**H（H）**). 在每种情况下，分析150个细胞，数据对应于平均值 ± SD.Bar 1，对照细胞；bar 2，pKT-3M转染的滋养体；bar 3，pKT-3M-EhPC4转染的滋养体。

**图3。EhPC4过表达增加细胞核数量和DNA含量。**
(A类)通过FACS分析获得细胞DNA含量谱。同步转染pKT-3M和pKT-3M-EhPC4的滋养体，培养96h，固定，PI染色。流式细胞术分析细胞DNA含量（x轴）。y轴表示细胞计数。(B类)荧光和共焦显微镜分析显示过度表达EhPC4的同步滋养体的形态和细胞核数量的变化。将pKT-3M和pKT-3M-EhPC4转染的滋养体培养不同时间（0、24、48、72和96小时），并用DAPI染色。(C类)巨大多核细胞的放大。箭头形，多形性巨大多核细胞（多核细胞）。(D类)来自250个随机选择的未转染对照、pKT-3M和pKT-3G-EhPC4转染细胞的每滋养体细胞核数(B类). (E类)96岁时未转染（对照）、pKT-3M和pKT-3G-EhPC4滋养体的细胞直径 h后同步。(F类)10例独立细胞分裂事件中胞质分裂不成功细胞的定量。(克)未转染（对照）、pKT-3M和pKT-3G-EhPC4转染的滋养体接受胞质分裂的典型延时图像。右下角显示的数字表示时间的相对流逝（以秒为单位）。箭头表示细胞质桥。

**图4。Myc-EhPC4细胞中的基因调控和EhNUDC过度表达滋养体中的胞质分裂失败。**
(A类)基于GO类别的Myc-EhPC4细胞中调制基因的转录组分析和分类。(B类)染色质免疫沉淀（ChiP）分析。检测EhPC4与选定基因启动子的结合。使用三对不同的引物对每个选定的基因启动子进行PCR扩增子的琼脂糖凝胶电泳（1%）。使用与总超声处理的DNA相对应的输入部分作为对照。底部图式中的数字表示引物在启动子中的位置。(C类)人类NUDC和EhNUDC蛋白质的示意图。显示了保守的P23-NUDC样结构域。(D类)在蛋白质印迹分析中使用抗Myc抗体对pKT-3M-EhNUDC转染的滋养体中的Myc-EhNUDC进行免疫检测。通道1，pKT-3M转染细胞（对照）；通道2，pKT-3M-EhNUDC转染细胞。(E类)免疫荧光和共焦显微镜分析显示使用抗Myc抗体在滋养体中Myc-tagged EhNUDC的细胞定位。用FITC-标记的二级抗体处理细胞，并用DAPI进行复染。绿色通道，Myc-tagged EhNUDC；蓝色通道，DAPI染色。(F类)pKT-3M-EhNUDC滋养体的生长动力学。(克). pKT-3M对照和pKT-3M-EhNUDC转染滋养体DAPI染色的荧光和共焦显微镜分析。红色箭头表示巨大的多核细胞。(**H（H）**)从250个随机选择的EhNUDC过度表达的滋养体中量化细胞核数。(我)未转染（对照）、pKT-3M和pKT-3G-EhNUDC转染的滋养体接受胞质分裂的典型延时图像。左上角显示的数字表示时间的相对流逝（以秒为单位）。箭头表示细胞质桥。

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1. Das S.&Lohia A.原生动物寄生虫溶组织内阿米巴S期和胞质分裂的脱钩。单元格。微生物。4, 55–60 (2002).-公共医学
1. Orozco E.、Solis F.J.、Domínguez J.、Chávez B.和Hernández F.溶组织内阿米巴：细胞周期和核分裂。实验寄生虫。67, 85–95 (1998).-公共医学
1. Dvorak J.A.、Kobayashy S.、Alling D.W.和Hallahan C.W.内阿米巴ssp DNA合成循环的阐释。使用流式细胞术和数学建模。《真核生物杂志》。微生物。42, 610–616 (1995).-公共医学

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[2] 世界卫生组织。阿米巴病。哇。流行病。记录72、97–99（1997）。-公共医学

[3] Gangopadhyay S.S.、Ray S.、Kennady K.、Pande G.和Lohia A.轴向生长的溶组织内阿米巴HM1中DNA含量和细胞周期基因表达的异质性：IMSS克隆A.Mol.Biochem。寄生虫醇。90, 9–20 (1997).-公共医学

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[5] Das S.&Lohia A.原生动物寄生虫溶组织内阿米巴S期和胞质分裂的脱钩。单元格。微生物。4, 55–60 (2002).-公共医学

[6] Das S.&Lohia A.原生动物寄生虫溶组织内阿米巴S期和胞质分裂的脱钩。单元格。微生物。4, 55–60 (2002).-公共医学

[7] Orozco E.、Solis F.J.、Domínguez J.、Chávez B.和Hernández F.溶组织内阿米巴：细胞周期和核分裂。实验寄生虫。67, 85–95 (1998).-公共医学

[8] Orozco E.、Solis F.J.、Domínguez J.、Chávez B.和Hernández F.溶组织内阿米巴：细胞周期和核分裂。实验寄生虫。67, 85–95 (1998).-公共医学

[9] Dvorak J.A.、Kobayashy S.、Alling D.W.和Hallahan C.W.内阿米巴ssp DNA合成循环的阐释。使用流式细胞术和数学建模。《真核生物杂志》。微生物。42, 610–616 (1995).-公共医学

[10] Dvorak J.A.、Kobayashy S.、Alling D.W.和Hallahan C.W.内阿米巴ssp DNA合成循环的阐释。使用流式细胞术和数学建模。《真核生物杂志》。微生物。42, 610–616 (1995).-公共医学

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