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.2016 3月18日;291(12):631-46。
DOI:10107/JBC.M115696211。 EPUB 2016 1月14日。

蛋白激酶Cα(PKCα)对长链甘油三酯刺激的长期脱敏/降调节作用

附属
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蛋白激酶Cα(PKCα)对长链甘油三酯刺激的长期脱敏/降调节作用

米歇尔等。 生物化学杂志. .
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摘要

PKCα的持续激活需要长期的生理反应,如生长停滞和分化。然而,药理激动剂(如佛波醇12肉豆蔻酸酯13乙酸乙酯(PMA))的研究表明,延长的刺激导致PKCα脱敏通过去磷酸化和/或降解。目前的研究分析了慢性刺激与生理激动剂甘油二酯的影响。重复加入1,2-二辛基-SN-甘油(DIG8)导致PKCα的持续质膜结合,与PMA诱导的模式相类似。然而,尽管PMA显著下调PKCα,但DIC8延长的激活未能参与已知的脱敏机制,该酶与膜相关并能够支持持续的下游信号。DK8激活PKCα不发生PKCα脱敏的早期磷酸化、泛素化或内化。虽然DIC8能有效下调PKC、PKCδ和PKC的表达,但Ca(2 +)敏感性和甘油二酯亲和力的差异被排除作为PKCα选择抗性的中介因子。还排除了HSP/HSC70和HSP90的作用。PMA,但不是DIC8,靶向PKCα到耐洗涤剂膜,并破坏这些结构域与胆固醇结合剂证明了在选择性激动剂诱导的降解中的差异膜分隔作用。慢性DIC8治疗未能使PKCα在几种细胞类型中脱敏,且不影响PKCβI;因此,常规PKC对持续的甘油二酯刺激通常对脱敏不敏感。与此结论一致,在小肠、子宫颈和皮肤的自我更新上皮中可见PKCα的延长(数天)膜结合/激活。PKCα缺乏可影响这些组织中基因表达、分化和肿瘤的发生,提示PKCα在体内对脱敏作用的保护机制的重要性。

关键词70千道尔顿热休克蛋白(HSP70);PKCα,脱敏;甘油二酯;热休克蛋白90(HSP90);脂筏;蛋白质降解;蛋白激酶C(PKC);蛋白磷酸化;信号转导。

数据

图1。
图1。
DIC对PKCα的激活和反易位. 我,面板A -C面板A在盖玻片上生长的IEC-18细胞用载体单独处理。控制装置),20μg/ml DIC,或100 NPMA为固定时间前的固定和处理,用于免疫荧光检测PKCα。这个闭箭头进入面板A指向PKCα的膜结合,而开放箭头表示B组表明酶反向转运到细胞质中。面板A,如用细胞或25μg/ml 1,2-二油酰基处理细胞。甘油1,2-狗)15分钟。C面板A用载体治疗细胞。控制装置)DiC或PMA存在或不存在200μmCHX。15分钟后,固定或处理PKCα免疫荧光细胞。面板-F)或用PBS洗涤两次,然后在含有载体或CHX的新鲜培养基中再培养1小时,然后再进行固定和加工(面板G-L开箭进入面板HIKL逆转易位后的胞浆PKCα。刻度尺10μm。图像代表了至少三个独立的实验。
图2。
图2。
脂质过氧化和激酶活性与PKCα逆转单个DIC易位的关系治疗 面板A将IEC-18细胞单独给予载体治疗。控制装置100 N苔藓抑制素布鲁伊)或20μg/ml DIC在没有或存在50μm的情况下制霉菌素纽约如所示。2后(左面板)或3小时右面板将细胞固定并进行PKCα免疫荧光处理。面板A,如除了用车辆或DIC治疗细胞外在没有或存在5μm的情况下双吲哚基马来酰亚胺ⅠBIM处理前15分钟或2小时。刻度尺10μm。图像代表了至少三个独立的实验。
图3。
图3。
DIC的重复加法在质膜上维持PKCα。IEC-18细胞的载体治疗控制装置或20μg/ml DIC. 每10分钟一次(面板-F或每1小时一次(面板A将培养基去除,用含有载体或DIC的新鲜培养基代替。像以前一样。在一定时间内,将细胞固定并进行PKCα免疫荧光定位。固定发生10分钟)或1小时)最后一次更换培养基后。箭头DIC中PKCα持续质膜结合的研究处理过的细胞刻度尺10μm。图像代表了至少三个独立的实验。
图4。
图4。
DIC的重复加法维持PKCα的下游信号转导。IEC-18细胞的载体治疗C或20μg/ml DICD在新鲜培养基中每1小时为处理前标记的蛋白质的Western印迹检测的指示时间。箭头指示4E-BP1的去磷酸化/活性形式的迁移。数据是三个独立实验的代表。
图5。
图5。
PKC激动剂慢性治疗对IEC-18细胞PKCα水平的影响 IIEC-18细胞单次处理100 N苔藓抑制素布鲁伊或PMA或每1小时用20μg/ml DIC治疗。在新鲜培养基中。在所指示的时间之后,对细胞进行处理,以对所指示的蛋白质进行Western印迹检测。在0h的时间点,用载体处理细胞2次。)或1小时C用载体治疗细胞。C或DICD在每10分钟的新鲜培养基中(或每1小时一次(C)在标记的时间之前进行Western印迹分析处理。D,如C除了20μMg132)或200μCHX包括在培养基中,如所示。所有的Western印迹面板显示单个印迹的数据。虚线指示车道为了清晰而重新排列。数据是至少三个独立实验的代表。
图6。
图6。
DIC延长激活不能诱导PKCα泛素化或去磷酸化。 IEC-18细胞用载体处理C),20μg/ml DICD),或100 N聚甲基丙烯酸甲酯)在提取和免疫沉淀前1小时(知识产权)使用识别总泛素的P4D1抗体。用Western印迹法分析泛素化PKCα存在时的免疫沉淀物(世界银行CD用载体治疗细胞。C),20μg/ml DICD100 N苔藓抑制素),20μMg132,1μ17-AAG和/或20μ如2所示的PES()或4小时CD并用Western blot分析PKCα和β-肌动蛋白的表达。用于控制和DIC经过处理的细胞,药物每1小时在新鲜培养基中重新服药。箭头成熟、完全磷酸化PKCα;箭头快速迁移,非磷酸化PKCα。所有的Western印迹面板显示来自单个印迹的数据;虚线进入指示为了清晰起见车道在哪里重新排列。数据是至少三个独立实验的代表。
图7。
图7。
低细胞内钙2 +DAG的亲和力较低,并不能解释PKCα在DIC激活后对其下调的不敏感性。. 面板AIEC-18细胞用载体处理控制装置或A23187钙离子载体的指示浓度。30分钟后,5μm在所有细胞中加入FurA-2 AM染料。额外的30分钟后,用PBS洗涤细胞,并由于Ca荧光。2 +用荧光显微镜观察FurA-2 AM。刻度尺,10μm。每小时用一辆车治疗细胞(C),20μg/ml DICD)并用Western blot法分析A23187在新鲜培养基中3小时的浓度,然后分析PKCα和β-肌动蛋白的表达。C转染表达HA标记的野生型PKCα的pGL2载体转染的IEC-18细胞W.T.或HA标记的Y123W突变PKCα(Y123W)每1小时用一辆车治疗(C100 N聚甲基丙烯酸甲酯)或20μg/ml DICD)在新鲜培养基中。4小时后,用免疫印迹法检测细胞,用抗HA抗体以及PKCδ和β-肌动蛋白表达HA标记PKCα蛋白。数据代表两个()或三个独立的实验(C
图8。
图8。
DAG代谢物对激动剂诱导PKCα下调的影响 用20μg/ml DIC处理IEC-18细胞D100 N聚甲基丙烯酸甲酯(或)车辆C在每1小时补充新鲜培养基中多巴(或相应的载体)的指示浓度存在或不存在的情况下,处理3小时后,对细胞进行PKCα和β-肌动蛋白水平的免疫印迹分析。,如除了用DIC治疗细胞外D)(PMA))或DIC结合PMA(PMA)付款交单对照细胞用等效体积的载体(乙腈)处理。数据是三个独立实验的代表。
图9。
图9。
PKCα与耐洗涤剂膜的关系 IEC-18细胞用载体处理控制装置),20μg/ml DIC,或100 N在100 m存在下,用冷1% Triton X-100提取30分钟之前的PMA 15分钟。氯化钙和同样级别的车辆,DiC或PMA与原处理一样。然后对裂解液进行不连续40%/30%/5%(W/V)蔗糖密度离心,等体积(20μL)梯度组分对PKCα进行Western blot分析。图显示密度计测定各组分中PKCα的相对水平。面板A在载体上生长的IEC-18细胞用载体DiC处理。或PMA,用1% Triton X-100提取30分钟。提取后立即用甲醛固定细胞,处理PKCα免疫荧光,用Hoechst 33258染色细胞核。图像在相同的放大倍数和曝光下获得并处理相同,显示PKCα(Alexa For 488)和核DNA(Hoechst 33258)的灰度染色。通过Hoechst染色证实细胞在盖玻片上的保留。刻度尺,10μm。CIEC-18细胞用载体处理C或100 N聚甲基丙烯酸甲酯)在存在或不存在指示浓度的菲林、制霉菌素或甲基-β-环糊精的情况下(βCD4后(I)或3小时)对细胞进行免疫印迹分析。进入I一个非特异性的带N.S.由UpStand生物技术公司检测到的抗PKCα抗体或免疫印迹膜的快速绿染色作为负载控制。D用载体治疗细胞。C),20μg/ml DICD),或100 N聚甲基丙烯酸甲酯在存在或不存在30米的情况下1-丁醇作为处理前指示PKCα和β-肌动蛋白的免疫印迹检测。所有的Western印迹面板显示单个印迹的数据。虚线进入C指示车道为了清晰而重新排列。数据代表两个()或至少三次独立实验CD
图10。
图10。
PKC激动剂对子宫内膜癌细胞PKCα和PKCβI的影响HEC-1-A和SNG-M细胞的载体治疗C100 N聚甲基丙烯酸甲酯)或20μg/ml DICD在新鲜培养基中每6分钟收获30小时,然后用Western blot分析所表达的蛋白的表达。数据是至少三个独立实验的代表。
图11。
图11。
上皮再生组织中PKCα的延长质膜结合体内.小肠上皮衬里PKCα表达及亚细胞分布的免疫组化分析I以及在宫颈鳞状上皮中的分层(鼠标显示。PKCα定位于肠隐窝增殖细胞的细胞质中(PKCα)C以及在宫颈鳞状上皮的基底/旁细胞层的有丝分裂细胞中(肠绒毛后有丝分裂成熟细胞V子宫颈上皮上层显示膜相关酶(箭头这个箭头进入,表明细胞停止分裂并参与分化的隐窝绒毛结。绒毛的成熟细胞向绒毛顶端迁移,并在2~3天的转运时间内被挤出到管腔中。

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