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.2016年2月；26(2):190-205.
doi:10.1038/cr.2016.4。 Epub 2016年1月15日。

SIRT6通过共同激活NRF2保护人骨髓间充质干细胞免受氧化应激

会泽盘 1 2, 狄观 1, 刘晓萌 3, 李静怡 3, 王丽霞 1 4 5, 吴军 6, 周俊之 1, 张伟洲 7, 若通任 1 4, 张伟奇 1 4, 李颖 1 2, 杨继平 1, 应浩 4 5, 庭庭园 1, 郭宏元 1, 胡旺 8, 振宇居 8, 毛志勇 9, 李健 10, 荆曲 5, 富州汤 3 11 12 13, 刘广辉 1 4 13 14
附属公司

SIRT6通过共激活NRF2保护人间充质干细胞免受氧化应激

会泽盘等。 单元格Res. 2016年2月.

摘要

SIRT6属于哺乳动物Sir2组蛋白NAD（+）依赖性脱乙酰酶家族的同源物。在啮齿类动物中，SIRT6缺乏导致中胚层组织老化相关变性。目前尚不清楚人类SIRT6是否在维持中胚层组织内环境稳定方面发挥直接作用。为此，我们通过靶向基因编辑产生了SIRT6敲除的人类间充质干细胞（hMSCs）。SIRT6缺陷的hMSCs表现出加速的功能衰退，这一特征与典型的细胞早衰不同。SIRT6-null hMSCs的主要特征是氧化还原代谢失调，对氧化应激的敏感性增加，而不是染色体稳定性受损。此外，我们发现SIRT6存在于一种蛋白复合物中，该复合物含有核因子-红细胞2相关因子2（NRF2）和RNA聚合酶II，这是NRF2调节的抗氧化基因（包括血红素氧化酶1（HO-1））的反式激活所必需的。在SIRT6缺失的hMSCs中HO-1的过度表达挽救了过早的细胞损耗。我们的研究揭示了SIRT6通过作为NRF2辅激活剂在维持hMSC内环境稳定中的新功能，它代表了氧化应激相关干细胞衰变的新调控层。

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数字

图1
图1
SIRT6公司-缺乏hMSCs会加速细胞磨损。（A）删除的示意图SIRT6公司通过删除第1外显子SIRT6公司通过基于TALEN的基因靶向技术获得基因。供体载体包含一个新霉素耐药盒（neo），允许阳性选择，然后将neo盒从SIRT6公司基因位点。（B）左面板：人胚胎干细胞SIRT6蛋白的western blotting分析。野生型（WT，SIRT6公司+/+)和SIRT6公司-不足(SIRT6公司−/−)使用抗SIRT6抗体通过western blotting分析hESCs。β-actin作为负荷对照。右侧面板：RT-PCR分析SIRT6公司hESCs中的mRNA。一对PCR引物跨越SIRT6公司采用mRNA外显子1和外显子2。18S rRNA作为负荷对照。（C）WT和SIRT6公司-缺乏hESCs。DNA经Hoechst 33342染色。亮场标尺，200μm；免疫荧光标尺，20μm；缩放场免疫荧光标尺，10μm。（D）WT和WT中表面标记CD105、CD73和CD90的亮场显微照片和FACS分析SIRT6公司-hMSCs缺乏。比例尺，100μm。（E）人骨髓间充质干细胞SIRT6蛋白的Western blotting分析。WT和SIRT6公司-用抗SIRT6抗体进行western blotting分析缺失的hMSCs。β-actin作为负荷对照。（F）免疫荧光分析显示细胞核中SIRT6蛋白缺失SIRT6公司-hMSCs缺乏。比例尺，10μm。（G）第6-8代的SA-β-GAL染色显示SIRT6公司-缺乏hMSCs。计算SA-β-GAL阳性细胞的百分比。数据表示为平均值±SEM，n个=5，NS，不显著**P（P）< 0.01.（H）人骨髓间充质干细胞P16和P21蛋白的Western blotting分析。WT和SIRT6公司-western blotting分析传代后期（LP，第9代）hMSCs缺陷。β-actin作为负荷对照。（一）免疫缺陷小鼠TA肌荧光素酶活性的分析体内成像系统（IVIS）显示SIRT6公司-植入后hMSCs缺乏。重量（1×106，左）和SIRT6公司-不足（1×106右）荧光素酶预转染的hMSCs（第6代）植入小鼠肌肉。植入后1周对荧光素酶活性进行成像和定量。数据表示为平均值±SEM，n个= 4, ***P（P）< 0.001.
图2
图2
hMSCs中SIRT6的消融导致ROS水平升高，并增加氧化损伤的易感性。（A）WT和SIRT6公司-缺陷hMSCs用载体（DMSO）或50μM PX-12处理24 h，通过FACS Annexin V-PI染色检测凋亡细胞。（B）的统计分析A类车辆处理的WT-hMSCs中的凋亡细胞百分比标准化为1。数据表示为平均值±SEM，n个=3，NS，不显著*P（P）< 0.05.（C）,D）通过H2DCFDA探针染色测定细胞活性氧（ROS）和8-oxodG水平（C）和抗8-oxodG抗体（D）分别由FACS测量。（E） SIRT6公司-用H预处理缺乏的hMSCs2O（对照）或1 mM NAC治疗1周，然后用载体（DMSO）或50μM PX-12治疗24 h。Annexin V-PI染色检测细胞凋亡。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, **P（P）< 0.01.（F）野生型SIRT6（SIRT6（WT）），而非SIRT6 H133Y突变体（SIRT6（HY））在SIRT6公司-hMSCs缺陷使细胞ROS部分恢复到正常水平。以荧光素酶（对照）表达载体作为对照。（G,H） SIRT6公司-缺陷hMSCs用SIRT6（WT）、SIRT6或对照载体转导，然后用载体（DMSO）或50μM PX-12处理细胞24小时（G）和细胞凋亡（H）分别用MTS法和Annexin V-PI染色法测定。中的数据G公司和H（H）以平均值±SEM表示，n个= 6, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图3
图3
hMSCs中NRF2依赖性HO-1表达需要SIRT6。（A）显示基因显著改变的火山图(q个-值<0.05，FC[SIRT6公司-不足/WT]<0.5或FC[SIRT6公司-WT和之间的缺陷/WT]>2）SIRT6公司-hMSCs缺乏。突出显示了具有代表性的NRF2靶基因（用箭头表示）。FC，折叠更改。（B）SIRT6缺失后hMSCs中显著下调基因的基因本体（GO）分析（生物过程）。（C）文氏图显示，早传代（EP，第6代）和晚传代（LP，第9代）hMSCs共有183个显著下调的基因SIRT6公司-与WT-hMSCs相比，hMSCs缺乏。表明NRF2靶基因在EP和LP中共享。（D）WT和WT中NRF2靶基因的RT-qPCR分析SIRT6公司-hMSCs缺乏。数值根据18S rRNA标准化。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.（E）NRF2靶基因基因体区域周围H3K4me3组蛋白修饰的平均分布SIRT6公司-缺乏和WT-hMSCs。TSS，转录起始位点；TTS，转录终止位点。（F）,G）RT-qPCR（F）和western印迹（G）WT和WT中HO-1表达的分析SIRT6公司-缺陷hMSCs用25μM PX-12处理指定时间。相对的mRNA和蛋白表达以折叠诱导方式呈现。对于RT-qPCR（F），值相对于18S rRNA进行归一化。数据以平均值±SEM表示，n个= 3, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.（H）SIRT6（WT）过度表达，而非SIRT6SIRT6公司-hMSCs缺陷部分恢复HO-1转录。根据18S rRNA对值进行归一化。数据以平均值±SEM表示，n个= 3, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图4
图4
SIRT6与NRF2相互作用并正向调节NRF2-ARE通路。（A）NRF2在WT和SIRT6公司-用ARE驱动荧光素酶报告子分析法检测hMSCs缺陷。WT和SIRT6公司-用pcDNA3.1（载体）或pcDNA3.1-NRF2（NRF2）以及ARE-核糖核酸酶和Renilla质粒转染缺陷hMSCs。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, *P（P）< 0.05.（B）表达GFP、SIRT6（WT）或SIRT6的质粒与NRF2或载体一起转染hMSCs，然后使用ARE-driven荧光素酶报告子测定NRF2活性。数据表示为平均值±SEM，n个=3，NS，不显著*P（P）< 0.05.（C）SIRT6过表达对原代hMSCs中NRF2靶基因激活的影响。用荧光素酶（对照）、SIRT6（WT）、SIRT 6（HY）或NRF2转导hMSCs，然后用RT-qPCR检测HO-1和AKR1C1转录物。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.（D）WT和SIRT6公司-用（UAS）转染缺陷hMSCs5-TATA-荧光素酶质粒与GAL4或GAL4-NRF2结合，然后测定NRF2的反式活性。数据表示为平均值±SEM，n个=3，NS，不显著**P（P）< 0.01.（E）WT和WT中NRF2反式性的荧光素酶分析SIRT6公司−/−hMSCs存在过度表达的GFP、SIRT6（WT）或SIRT 6（HY）。数据表示为平均值±SEM，n个=3, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.（F）（UAS）的ChIP-qPCR分析5-hMSCs共表达（UAS）中的相关SIRT65-使用抗标记抗体的TATA-荧光素酶、GAL4-NRF2和标记-SIRT6。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, **P（P）< 0.01.（G）共免疫沉淀（Co-IP）显示SIRT6和NRF2形成蛋白质复合物。用所示抗体进行外源性（上部和中部面板）和内源性（下部面板）Co-IP。（H）GST-NRF2或GST蛋白大肠杆菌与HEK293T细胞表达的Flag-SIRT6孵育。GST下拉分析表明在体外NRF2和SIRT6之间的相互作用。
图5
图5
SIRT6使H3K56去乙酰化，并且是将RNAP II募集到HO-1基因启动子所必需的。（A）利用表达Flag-SIRT6的HEK293T细胞的蛋白提取物进行Co-IP分析表明，SIRT6与RNAP II和TAF II-p135形成蛋白质复合物。（B）在中执行ChIP-qPCRSIRT6公司−/−用Flag-SIRT6或Flag萤光素酶转导的hMSC（对照）表明SIRT6与HO-1启动子和增强子的关联。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.（C）ChIP-qPCR分析显示HO-1启动子处依赖SIRT6的RNAP II募集。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, *P（P）<0.05.（D）WT和WT中H3K56Ac、H3K9Ac和H3K4me3的蛋白质印迹分析SIRT6公司-hMSCs缺乏。组蛋白3（H3）用作负荷对照。（E）WT和WT中H3K56Ac水平的免疫荧光（左）和统计（右）分析SIRT6公司-hMSCs缺乏。比例尺，100μm。（F）H3K56Ac和H3K9Ac在WT和HO-1启动子处富集的ChIP-qPCR分析SIRT6公司-hMSCs缺乏。数据表示为平均值±SEM，n个=3，NS，不显著**P（P）< 0.01.（G）WT或WT中HO-1启动子处H3K56Ac的ChIP-qPCR分析SIRT6公司-用编码SIRT6（WT）、SIRT6的慢病毒载体或荧光素酶（对照）转导缺陷hMSCs。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, **P（P）< 0.01.
图6
图6
受损的NRF2-HO-1轴解释了SIRT6公司-hMSCs缺乏。（A）FACS分析用编码荧光素酶（对照）或HO-1的慢病毒载体转导的hMSCs中的ROS水平。（B）用编码荧光素酶（对照）或HO-1的慢病毒载体在50μM PX-12治疗的情况下转导的所示hMSCs中的乳酸脱氢酶（LDH）检测。数据表示为平均值±SEM，n个= 3, *P（P）< 0.05.（C）FACS分析用编码荧光素酶（对照）或HO-1的慢病毒载体转导的hMSCs中PX-12诱导的细胞毒性（左侧面板）。用载体（DMSO）或50μM PX-12处理细胞24小时。凋亡细胞的统计分析（右面板）以平均值±SEM表示。n个= 6, **P（P）< 0.01.（D）IVIS检测免疫缺陷小鼠的荧光素酶活性。SIRT6公司-缺乏hMSCs过度表达GFP+荧光素酶（对照组，左）和SIRT6公司-将过表达HO-1加萤光素酶的缺陷hMSCs（右）植入小鼠的TA肌肉中。植入6天后，小鼠腹腔注射20 mg/kg PX-12 24 h，然后测量荧光素酶活性。数据表示为平均值±SEM，n个= 4, *P（P）< 0.05.（E）SIRT6介导的hMSCs氧化还原调控的假定模型。在野生型hMSCs中，SIRT6是通过共激活NRF2抗氧化途径实现细胞氧化还原稳态的关键调节因子。SIRT6与NRF2靶基因（即HO-1）启动子处的NRF2和脱乙酰化物H3K56相关，这是RNAP II复合物的招募和NRF2的后续反式激活所必需的。在SIRT6公司-hMSCs缺陷、SIRT6缺陷导致H3K56Ac水平升高，RNAP II复合物对HO-1启动子的募集受损，导致HO-1表达降低，细胞氧化还原平衡受损。
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中的注释

  • SIRT6、氧化应激和衰老。
    Liao CY，Kennedy BK公司。 廖CY等。 Cell Res.2016年2月；26(2):143-4. doi:10.1038/cr.2016.8。Epub 2016年1月19日。 2016年细胞研究。 PMID：26780861 免费PMC文章。

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